急性心肌梗死后钾通道KCNH2和KCNE2基因表达的变化

李秀娟 曾 超 丁家望 吴 辉 李 莉 李 松 李稳慧 姜玉蓉 杨 俊

(宜昌市中心人民医院心血管内科，湖北 宜昌 443003)

钾通道(kr)对心肌细胞的电生理稳定性调控起着非常重要的作用〔1，2〕。人类ether--go-go相关基因HERG基因编码心脏快速延迟整流钾电流(Ikr)，Ikr是心肌细胞动作电位3期快速复极的主要电流，在心脏动作电位复极化过程中发挥重要作用。HERG及其调节亚基KCNE2基因突变可引起LQTs 综合征〔3，4〕。心肌梗死(MI)后心室肌膜多种kr基因表达的的变化已成为近年研究热点，但是关于MI后krHERG基因表达变化的研究很少，尤其是对大型动物如猪的研究尚属少见。本实验用RT-PCR 方法观察MI后左心室不同部位快速延迟整流钾通道Kr基因HERG及其调节亚基KCNE2基因的mRNA表达改变及其意义，旨在探讨急性心肌梗死(AMI)后早期室性心律失常发生的分子机制。

1 材料和方法

1.1实验动物 普通级小型猪，体重10～15 kg(华中农业大学动物中心提供)，雌雄不限。术前常规检查心电图,心电图异常者剔除，随机分为假手术组和模型组(MI组)，共16只动物。

1.2MI动物模型的建立 所有实验动物术前均禁食、禁饮12 h。术前称重,予以3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后，在口腔明视下行气管插管,以呼吸机机械通气,潮气量10～15 ml/kg，给氧3～5 L/min，频率20～25次/min。常规消毒铺巾，于胸骨正中打开胸腔,纵行切开心包膜,充分暴露心脏,并将心包膜缝合于胸壁呈吊篮状。仔细分离冠状动脉,于冠状动脉左前降支(LAD)远端1/3～1/2处穿入4号缝合线,AMI组结扎2 h,再松解4 h,建立AMI模型,其成功标志为:心电图ST段弓背向上抬高,直视下可见被结扎血管供血区心肌变为苍白色。假手术组也重复上述步骤,但冠状动脉下只穿线,不结扎。逐层缝合心包、胸壁，并放置引流管。术后精心喂养动物至实验终点。取结扎后存活的猪,分入MI组,建立假手术组,所有猪均接受相同的饲养条件。

1.3标本的采集与保存 两组均于术后24 h,用3%的戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后，迅速取出心脏置于4℃预冷的生理盐水漂洗除去血液，MI组取左心室梗死区,梗死边缘区,非梗死区心肌组织各300 mg,同样留取SH组左心室对应部位心肌组织各300 mg,立即放入液氮中保存备用。

1.4心肌总RNA的提取和KCNH2和KCNE2 mRNA检测 取50～100 mg猪心肌,应用TRIZOL匀浆，提取组织总RNA，紫外光检测样品吸光度，A260/A280为1.95-2.10。应用RT-PCR法(通用RT-PCR试剂盒购于大连宝生物工程有限公司)检测mRNA的表达,50℃ 30 min,94℃预变性2 min,PCR扩增29个循环(94℃变性30 s,退火30 s,72℃延伸4 min)后，1.5%琼脂糖电泳分析PCR产物,应用凝胶成像系统观察记录结果,用光密度扫描计算KCNH2电泳条带灰度积分/β-actin电泳条带灰度积分和KCNE2电泳条带灰度积分/β-actin电泳条带灰度积分，进行半定量分析。各目的基因引物及β-actin引物序列、片段长度、退火温度见表1。

表1 目标基因与内参基因引物序列及PCR反应条件

1.5统计学分析 应用SPSS11.5软件进行方差分析。

2 结 果

2.1动物存活情况 MI组中9只猪存活6只,另外3只于术中发生室颤，经心内除颤无效死亡;假手术组中7只猪，1只因麻醉意外死亡,其余6只存活。

2.2猪心肌KCNH2和KCNE2基因mRNA表达的变化 假手术组KCNH2和KCNE2 mRNA的表达在梗死对应区、梗死边缘对应区、非梗死对应区之间无明显差异(P>0.05)(见图1、图2)。MI 组KCNH2 mRNA 表达在梗死区较假手术组下调(P<0.05)；在梗死边缘区较假手术组下调(P<0.05)；在非梗死区较假手术组无明显差异(P>0.05)。同时，KCNH2 mRNA 表达在梗死区和梗死边缘区无明显差异(P>0.05)，但较非梗死区下调(P<0.05)(见表2及图1)。MI 组KCNE2 mRNA 表达在梗死区较假手术组降低(P<0.05)，而梗死边缘区和非梗死区较假手术组无明显差异(P>0.05)。同时KCNE2 mRNA 表达在梗死区较梗死边缘区和非梗死区下调(P<0.05)，但梗死边缘区和非梗死区之间的表达无明显差异(P>0.05)(见表2及图2)。

表2 两组不同部位KCNH2、KCNE2基因mRNA的表达±s)

1：MI组梗死区；2：MI组梗死边缘区；3：MI组非梗死区；4：假手术组梗死对应区；5：假手术组梗死边缘对应区；6：假手术组非梗死对应区；下图同

图2 两组不同部位KCNE2 RT-PCR电泳图

3 讨 论

近年来，人体遗传分子学和生物学对先天性Q-T间期延长综合征的研究，已突破性地揭示出心肌细胞有关离子通道基因表达的缺陷与心肌节律紊乱之间的关系，表明通道基因表达的异常是心律失常产生的机制之一〔5〕。kr在心肌细胞的电生理稳定性调控中起着非常重要的作用。IKr是HERG(KCNH2)和KCNE2(MiRP1)表达的两种蛋白质共同形成功能性kr，KCNH2本身单独可产生一种小的快速激活外向Ikr，KCNE2本身并不能产生任何离子电流，但它的存在主要影响通道的门控性和药理学性质。HERG及其调节亚基KCNE2基因突变可引起LQTs 综合征。但在MI后HERG及其调节亚基KCNE2基因的表达有何改变，这些改变在心律失常中所起的确切作用尚不是很清楚。Pinto等〔6〕研究发现MI后24 h犬的浦肯野纤维细胞上对E-4031敏感的电流增加，但是这种电流在正电位时缺乏内向整流特性，所以说这种电流也并非是真正意义上的Ikr。Jiang等〔7〕研究发现MI后2 d犬心室肌细胞的延迟整流Ikr的幅度减低及其动力学发生改变，Ikr激活和Iks失活加速，他们认为这些变化归因于有功能的相应通道减少和/或通道亚单位成分的改变。Huang等〔8〕在大鼠MI模型研究中发现Ikr密度呈时间依赖性降低，动作电位时程延长，认为这些变化是MI后心脏早期致心律失常的原因。由此可见，MI后Ikr电流的电生理特性发生了改变，这可能是MI后易发心律失常的机制之一。

本研究KCNH2mRNA变化可能是MI后Ikr电流电生理特性发生改变的分子基础。KCNH2基因mRNA的表达水平下调，可以造成有功能的快速延迟整流kr的数目减少，有助于Ikr电流的减小，可能是心肌细胞在恢复期的一种代偿性保护性反应，使膜Ikr变小，钾离子外流减少，促进急性缺血所造成的细胞内外K+平衡失调的恢复。但是Ikr电流的减小，可使心室肌细胞APD延长，心肌细胞电生理特性改变，易于形成触发活动，产生心律失常。同时KCNE2基因mRNA表达水平的下调，使Ikr在整体行为，对细胞外K+及抗心律失常药物的敏感性和通道的失活速率等方面发生改变，增加了电流的不稳定性和发生心律失常的易感性。再者由于，KCNH2和KCNE2 mRNA的表达在梗死区、梗死边缘区、非梗死区之间产生了明显的差异，使空间异质性增大，可导致复极不均一，复极离散度增大，易于形成折返发生心律失常。

因此，kr基因KCNH2和KCNE2 mRNA表达的下调和在不同部位改变的不均一可能在电生理不稳定的维持和(或)恶化方面起一定的作用，但这种变化的确切意义和KCNH2和KCNE2基因两者之间的相互作用还有待深入研究。

4 参考文献

1Pongs Olaf.Ins and outs of cardiac voltage-gated potassium channels〔J〕.Curr Opin Pharmacol，2009；(3):311-5.

2Shimizu Wataru,Horie Minoru.Phenotypic manifestations of mutations in genes encoding subunits of cardiac potassium channels〔J〕.Circulation Res，2011；109(1):97-109.

3Roden DM.Long-QT syndrome〔J〕.N Eng J Med，2008；358(2):169-76.

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6Pinto JMB,Boyden PA.Reduced inward rectifying and increased E-4031-sensitive K+ current density in arrhythmogenic subendocardial Purkinje myocytes from the infarcted heart〔J〕.J Cardio Electrophy，1998；9:299-311.

7Jiang M,Yao JA,Wymore RS,etal.Suppressed transcription and function of delayed rectifier K channels in post-infarcted heart〔J〕.Circulation，1998；98:811-8.

8Huang B,Qin D,El-Sherif N.Early down-regulation of K channel genes and currents in the post-infarction heart〔J〕.J Cardiol Electrophy,2000;11(11):1252-61.