人粪便中UNC5C基因甲基化在早期诊断大肠癌中的临床意义

孙冬生 王 刚 王明君 钟 轩 费乐学

(唐山开滦总医院肿瘤科，河北 唐山 063000)

早期发现的大肠癌病变，有助于将局限在肠壁的肿瘤及时行外科手术切除，而且手术治愈率可高达90%〔1〕；但晚期并有淋巴转移的患者预后较差，5年生存率只有5%〔2〕。研究表明，通早期筛查大肠癌可降低大肠癌的死亡率及提高患者5年生存率〔3〕。UNC5C基因可能参与大肠癌的发生过程〔4〕。因此，本研究通过重亚硫酸盐限制性内切酶法(COBRA)方法检测人粪便中UNC5C基因甲基化的状态，探究人粪便中UNC5C基因甲基化对于早期诊断大肠癌的临床意义。

1 资料和方法

1.1一般资料 选取2010年12月至2013年12月我院收治的大肠癌病人52例及健康体检者40例，所有患者均经病理检查确诊。大肠癌患者男28例，女24例，年龄39～75〔平均(60.4±14.6)〕岁；健康体检者男20例，女20例，年龄41～72〔平均(59.3±13.5)〕岁；经检验两类研究对象的年龄和性别差异无统计学意义(P>0.05)。所有的研究对象均在知情下签署同意书，大肠癌纳入标准〔5〕：(1)只患大肠癌，无其他肿瘤；(2)首次确诊病例；(3)收集标本前未治疗和操作性肠道检查；(4)无其他重要脏器，如心、肺、肾等的病变。

1.2主要仪器 德国Analytik Jena AG公司的flexcycler PCR仪；美国Bio-Rad公司 PowerPacTM Basic Power Supply型电泳仪；美国Bio-Rad公司Sub-Cell GT 电泳槽；加拿大carestream公司的Gel Logic 212 PRO型凝胶成像的分析系统；美国Thermo公司Ultro freeze 3410超低温冰箱；中国宁波永新光学股份有限公司NIB-100型显微镜；美国应用生物系统公司(ABI)，310测序仪等。

1.3主要试剂 PCR扩增引物中各序列均由上海的英骏公司设计合成；琼脂糖产于美国的Promega公司；宝生物TEXPAT试剂盒；EZ DNA Methylation KitTM。亚硫酸盐(sigma)、苯二酚(Hydroquinone，sigma)、缓冲液(Promega 公司)

1.4粪便DNA提取 取1 mg粪便放入装有1.5 ml裂解液(1 mol/L Tris 5 ml+0.5 mol/L EDTA 1 ml)的2 ml离心管中，95℃加热10 min后充分振荡；5 000 r/min离心5 min(室温)；取上清液放入新的2 ml离心管中。改良的亚硫酸盐液体配制：取1.8 g亚硫酸盐，放入50 ml离心管中；加入纯净水2 ml、12.5 mol/L的NaOH 100 μl及10 mmol/L对苯二酚300 μl。充分振荡后微波炉加温(数秒钟)，再次振荡使之完全溶解。粪便上清液200 μl+上述2溶液150 μl(最终亚硫酸盐浓度2.63 mol/L)；温度条件：95℃ 15 min，4℃ 10 min，75℃ 60 min。取350 μl的M-Binging缓冲液，放入经过上述处理后的溶液中，混匀后放入Zymo-Spin IC Column中500 r/min离心5 min(室温)；加入M-Desulphonation缓冲液200 μl，500 r/min离心5 min(室温)；此操作充分两次。最后加入纯净水40 μl，室温放置10 min后离心。溶出液作为PCR扩增时DNA模板使用。

1.5甲基化引物(荧光标记) UNC5c区域1正义：GTYGGTTGGGGTAGTGTAAAAGTT，荧光标记VIC；反义：AACCTACCRCCTACCACCTTCTTC，产物长度：175 bp，酶切后长度：175 bp，146 bp；HhaⅠ 37℃,12 h。区域2正义：TTTAGTGGGGTTTTTAGTTGTTTG，反义：TATCCCAATCCCAATCCRCAAC，荧光标记FAM，产物长度：125 bp，酶切后长度：125 bp，100 bp；Hha Ⅰ37℃，12 h。

2 结 果

2.1经酶切后310测序仪电泳结果 经酶切后310测序仪电泳结果显示，大肠癌患者粪便UNC5C 区域1和区域2均呈现甲基化，健康人群粪便UNC5C无广泛甲基化。

2.2各组对象粪便标本甲基化情况比较 广泛UNC5C的甲基化(区域1和区域2均甲基化)及部分甲基化(区域1或区域2均甲基化)在大肠癌患者粪便、健康体检者中分为81%(42/52)及54%(28/52)；0%(0/40)及10%(4/40)。大肠癌患者10例、健康体检者36例粪便标本中无甲基化(P<0.05)。无论广泛还是部分UNC5C的甲基化率大肠癌患者粪便的检出率均明显高于健康体检者(P<0.05)。

2.3大肠癌患者与COBRA法检测粪便的相关病理资料的关系 大肠癌患者COBRA检测粪便结果与患者的性别，年龄，肿瘤发生部位，肿瘤大小以及肿瘤分期没有显著的相关性(P>0.05)。见表1。

表1 COBRA法检测结果与大肠癌患者临床病理资料的关系〔n(%)〕

3 讨 论

目前临床上大肠癌筛检常用粪便隐血检查，肠镜检查等。粪便隐血检查的灵敏度较低，肠镜检查给受检者带来巨大的不适感，也十分不方便。而粪便中DNA甲基化检测技术是作为一种新型的技术，分析粪便中DNA的异常甲基化程度，优化了两种方式的优点，有较高的灵敏度和特异度，而且这种检验方法是非侵袭性的。目前许多研究证实了粪便中DNA甲基化检测的可行性，但许多实验的结果并不稳定，得出的灵敏度和特异度的差异较大〔6〕，而且没有固定的特异性的基因作为诊断标记物。我国的学者研究粪便中Vimentin基因以及SFRP2基因甲基化的研究较多〔7〕，也一定程度上证实了两种基因甲基化检测的可行性，但结果并不十分乐观。UNC5H基因表达神经生长因子受体netrin-1，受体的表达情况可能与肠癌、肾癌以及乳腺癌等多种癌症有关，其中与大肠癌最为相关的是UNC5A和UNC5C两个亚型〔4〕。

本研究发现大肠癌患者粪便UNC5C 区域1和区域2均呈现甲基化，健康人群均无广泛甲基化，但仍有部分甲基化。提示UNC5H基因甲基化的状态和大肠癌的发生相关，粪便中UNC5H基因甲基化在早期就开始发生，可能与早期的癌症发生有关〔8〕。相关研究结果也提示，粪便中UNC5H基因甲基化的状态检测能早期检测大肠癌的癌前病变〔9，10〕。另外，大肠癌患者粪便中UNC5H基因甲基化阳性检出率与临床病理特征无显著相关性，总体与其他学者的研究相符〔8，11〕，显示了粪便中UNC5H基因甲基化检测的相对稳定性。

4 参考文献

1朱其勇，吴 可，黄海宁，等.T3期大肠癌患者新辅助化疗与手术前后外周血T细胞亚群变化的研究〔J〕.现代生物医学进展，2013；13(12)：2261-4.

2Lv D，Zhao W，Dong D，etal.Genetic and epigenetic control of UNC5C expression in human renal cell carcinoma〔J〕.Eur J Cancer，2011；47(13)：2068-76.

3Purohit AA，Li W，Qu C，etal.Down syndrome cell adhesion molecule (DSCAM) associates with uncoordinated-5C (UNC5C) in netrin-1-mediated growth cone collapse〔J〕.J Biol Chem，2012；287(32)：27126-38.

4武 洁，陈学军.Netrin-1受体UNC5C和DCC抑癌作用的研究进展〔J〕.生命科学，2009；4(1)：112-5.

5Kim D，Ackerman SL.The UNC5C netrin receptor regulates dorsal guidance of mouse hindbrain axons〔J〕.J Neurosci，2011；31(6)：2167-79.

6Auger ML，Schmidt ER，Manitt C，etal.unc5c haploinsufficient phenotype：striking similarities with the dcc haploinsufficiency model〔J〕.Eur J Neurosci，2013；38(6)：2853-63.

7刘旭东.大肠癌中Netrin-1依赖性受体DCC、UNC5C表达与细胞凋亡的相关性研究〔D〕.天津：天津医科大学硕士论文，2006.

8Dillon AK，Jevince AR，Hinck L，etal.UNC5C is required for spinal accessory motor neuron development〔J〕.Mol Cell Neurosci，2007;35(3)：482-9.

9武 洁，陈学军，薛占瑞，等.大肠癌组织中unc5c基因启动子甲基化的分析〔J〕.肿瘤防治研究，2010;37(6)：683-6.

10王乾华，朱剑文，钟少平，等.UNC5B在人早孕胎盘微血管内皮细胞中的表达及意义〔J〕.中国妇幼保健，2010;13(36)：5454-6.

11Kury S,Garrec C,Airaud F,etal.Evaluation of the colorectal cancer risk conferred by rare UNC5C alleles〔J〕.World J Gastroenterol，2014;20(1)：204-13.