健胃消食片对滞脾碍胃大鼠脂肪组织脂联素表达的影响

林 斌 冯伟峰 孙升云

(梅州市中医医院内科，广东 梅州 514011)

中医认为滞脾碍胃多为后天喂养失和，过食肥甘厚味，脏腑失调，脾胃虚弱，食滞化热所致，病变脏腑在脾胃，发病机制在于脾运胃纳功能的失常。在中医临床运用方面，醒脾为治疗大法，健胃则是治疗的关键，两者配合，可以取得较好的疗效。健胃消食片由太子参、陈皮、山药、麦芽(炒)和山楂5味中药材制备而成，有健胃消食的功效，用于脾胃虚弱，消化不良等症，收载于卫生部药品标准中药成方制剂第十六册〔1〕。本实验观察健胃消食片对脂肪组织脂联素mRNA表达的影响。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器 YP601N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)，-80℃超低温冰箱(SANYO公司)，全自动生化分析仪(日本Olympus公司)，台式高速离心机(北京医用离心机厂)，冷冻离心机(Beckman公司)，微量加样器(德国Eppendorf公司)，Trirol试剂、DEPC 和Taq酶(均为TaKaRa公司)，乙醇、异丙醇和氯仿(均为广州化学试剂厂)，Reverse Transcriptase、Rnase Inhibitor、5×Reaction Buffer、Random Primers、10×PCR Buffer和dNTP(均为TIANGEN公司)，UNOⅡ型PCR扩增仪(Biometra公司)，DNA Marker(北京鼎国生物技术有限公司)，琼脂糖粉(Sigma公司)，数据处理与分析系统及凝胶分析系统(Kodak公司)，脂联素引物和β-actin引物(均为广州达安临床检验中心有限公司)。

1.2实验药物 健胃消食片(江中药业股份有限公司生产，国药准字：Z20013220，产品批号：0611710)。

1.3实验动物 SPF级SD大鼠60只，雌雄各半，广东省实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK(粤)2007-0002。

1.4饲料配制 基础饲料：购自广东省实验动物中心； 特制高脂饲料配方：猪油∶奶粉∶鱼松∶豆粉∶玉米粉∶白糖∶鲜鸡蛋按照2∶1∶1∶2∶1∶1∶1.8的比例进行配制。其中，奶粉、鱼松、豆粉、玉米粉、白糖和鲜鸡蛋(市售)，猪油(红枫叶牌)批号：20070113，购于广州加益食品有限公司，于暨南大学实验动物中心加工。

1.5动物分组和模型建立 60只SD大鼠随机分为空白组(n=18)和造模组(n=42)，其中空白组进食标准基础饲料，造模组给予特制高脂饲料喂饲。4 w后，以食量低于对照组平均食量20%和体重低于对照组平均体重20%为滞脾碍胃模型大鼠标准，实验组中有36只大鼠符合标准。滞脾碍胃大鼠随机分为健胃消食组及高脂对照组各18只，健胃消食组除高脂饲养外，于每日上午予灌服健胃消食片0.72 g/kg，高脂对照组继续高脂饲养，空白组大鼠正常喂饲，共进行4 w。

1.6实验指标测定

1.6.1体重和食量测定 每周用电子天平测体重(精确到0.1 g)一次，同时每周计算并记录每组的平均食量(精确到0.01 g)。大鼠的平均食量为每组大鼠每只的平均值，合笼喂养，食量是每天平均耗食量。

1.6.2谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)测定 用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，取腹部脂肪组织分别称取湿重。打开腹腔，自腹主动脉直接采血4～6 ml，装入抗凝管，分离血清，以全自动生化分析大鼠血清AST、ALT的含量。

1.6.3脂肪组织脂联素mRNA表达 取脂肪组织100～150 mg，Trizol一步法提取总RNA。提取后-80℃保存。取RNA样品用紫外分光光度仪测定样品在260 nm波长下的光密度吸收值(A260)，计算其浓度及含量。RNA浓度(μg/μl)=A260×40×稀释倍数/1 000。RNA样品经1.5%琼脂糖凝胶电泳1 h，在凝胶紫外透视仪下可观察到两条清晰的条带，说明所提取的RNA完整无降解。取RNA样本3 μl，通过逆转录方法，将RNA还原成cDNA，放入-20℃冰箱保存。总反应体积为25 μl，采用合适的反应体系，其中脂联素上游引物(5′-CAG GAG ATG CTG GAA TGA CAG G-3′),脂联素下游引物(5′-CGT AGG TGA AGA GAA CGG CCT T-3′)，扩增产物为321 bp；β-actin上游引物(5′-CTC TGG TCG TAC CAC TGG CAT T-3′)，β-actin下游引物(5′-TCC TGC TTG CTG ATC CAC ATC-3′)，扩增产物为651 bp；在冰上操作，脂联素mRNA和内标β-actin同管扩增。PCR反应结束后，取10 μl PCR产物，加1.5%琼脂糖上电泳，电泳缓冲液为0.1×TAE，电泳电流100 mA，时间为30 min。紫外监测仪下摄片，用图像扫描仪对底片进行灰度扫描，凝胶电泳分析软件分析。以脂联素mRNA与β-actin电泳条带灰度值之比(脂联素mRNA/β-actin)作为反映脂联素mRNA表达的相对指标。

2 结 果

2.1造模4 w过程中高脂及普通饲料喂养大鼠的平均食量及体重变化 予以特制高脂饲料喂养的SD大鼠表现为食欲下降，食量减少，体重下降。至4 w时，两组大鼠的平均食量比较有明显差异(P<0.05)，见表1。两组大鼠的体重有明显统计学差异(P<0.01)，见表2。本结果说明用特制高脂饲料造滞脾碍胃大鼠模型4 w成模。

2.2健胃消食片对实验性滞脾碍胃大鼠肝功水平的影响 高脂对照组和健胃消食组大鼠血清肝功能AST、ALT水平无明显变化，与空白组比较无统计学意义(P>0.05)。健胃消食组大鼠与高脂对照组大鼠相比，其血清AST、ALT水平与高脂对照组无明显差异(P>0.05)。见表3。

2.3健胃消食片对滞脾碍胃大鼠脂肪组织脂联素mRNA表达的影响 与空白组比较，高脂对照组大鼠脂肪组织脂联素mRNA表达明显升高(0.328±0.016 vs 0.18±0.017，P<0.05)，而健胃消食片组大鼠脂肪组织脂联素mRNA的表达水平低于高脂对照组大鼠(0.275±0.022，P<0.05)。见图1。

表1 高脂及普通饲料喂养大鼠的平均食量变化

表2 高脂及普通饲料喂养大鼠的体重变化

表3 健胃消食片对大鼠肝功能水平的影响

图1 各组脂联素mRNA和β-actin的电泳条带图

3 讨 论

用含猪油20%的饲料喂养大鼠，大鼠食量减少〔2〕。本实验在配制饲料的过程中增加了猪油的含量，目的就是增加出现饮食诱导滞脾碍胃大鼠的百分比，结果证明此方法行之有效。

本实验中滞脾碍胃大鼠模型的肝功能是正常的，即给予特制高脂饲料8 w对SD大鼠的血清AST、ALT水平无影响，可能是因为进食量明显降低，进食高脂饲料很少，对SD大鼠肝功能未造成损害。本实验还表明健胃消食片没有肝功能损害。

脂联素是脂肪细胞分泌的蛋白激素，其编码基因是代谢综合征(MS)的易感位点〔3〕。其基因定位于人类染色体3q27，是调节代谢综合征病理过程的中心环节〔4〕，Scherer等〔5〕首先从鼠的脂肪细胞中分离出来的一种蛋白质。脂联素具有改善胰岛素抵抗(IR)、抗炎、抗动脉粥样硬化的作用〔6〕。血浆脂联素水平与胰岛素敏感性呈正相关，与体重指数(BMI)、体脂百分比(BF%)呈负相关，肥胖特别是内脏脂质增多的患者血浆脂联素水平降低，体重减轻后脂联素水平会回升，IR也明显改善〔7〕。

据报道，在啮齿类动物，急性注射脂联素可减少肝脏葡萄糖输出，在体内脂联素还可减少肌肉和肝脏甘油三酯含量，同时上调涉及脂肪酸氧化的基因的表达，增加脂肪酸氧化的作用〔8〕。本实验说明健胃消食片可以减少滞脾碍胃大鼠脂肪组织脂联素mRNA的表达水平，减少脂肪酸氧化。

4 参考文献

1徐韧柳，王永欣.健胃消食片质量标准研究〔J〕.中成药，2006；28(4)：506-7.

2刘利民，叶恭绍，叶广俊.高脂饲料致大鼠肥胖的实验研究〔J〕.北京医科大学学报，1991；23(5)：359-61.

3Vasseur F，Leprêtre F，Lacquemant C，etal.The genetics of adiponectin〔J〕.Curr Diab Rep，2003；3(2)：151-8.

4李 猛，杨丽军，董爱勤，等.脑梗死血清脂联素与血脂相关性的临床研究〔J〕.脑与神经疾病杂志，2008；16(4)：280-1.

5Scherer PE，Willians S，Fogliano M，etal.A novel serum protein similar to Clq，produced exclusively in adpoeytes〔J〕.J Biol Chem，1995；270(45)：26746-9.

6朱俐俐，郭立新，刘庚勋.福辛普利、氯沙坦对自发性高血压大鼠脂肪组织脂联素的影响〔J〕.心血管康复医学杂志，2009；18(1)：53-4.

7Kim DM，Yoon SJ，Ahn CW，etal.Sibutramine improves fat distribution and insulin resistance，and increases serum adiponectin levels in Korean obese nondiabetic premenopausal women〔J〕.Diabet Res Clini Prac，2004；66(1)：S139-44.

8Yamauchin T，Kamon J，Waki H，etal.The fat-derived hormone adiponectin reverses insulin resistance associated with both lipoatrophy and obesity〔J〕.Nat Med，2001；7(8)：941-6.