MT01抑制Pg感染小鼠单核/巨噬细胞内NLRP3 mRNA的表达

郭 恪 申玉芹 丁子清 周 岳 于海蛟 林崇韬

(吉林大学口腔医学院牙周病科,吉林 长春 130021)

牙周病是一种慢性感染性疾病，已有研究表明，NLRP3炎症小体作为天然免疫的重要组分与牙周病的发生发展具有密切关系〔1，2〕。单核/巨噬细胞作为牙周宿主防御机制的重要组成部分，在动员宿主的抗菌防御中发挥重要作用〔3〕。由于能被多种类型的病原体或危险信号所激活，作为炎症反应的核心，NLRP3炎症小体可能为各种炎症性疾病的治疗提供新的靶点〔4〕。如果能抑制NLRP3炎症小体的激活，可能对干预牙周病具有积极作用。在前期研究中发现，MT01是一类根据人线粒体DNA序列设计的单链寡脱氧核苷酸，具有选择性免疫负调节活性，能在大鼠牙周炎模型中抑制牙槽骨吸收，并且能抑制由TLR9激活引起的固有免疫应答反应〔5,6〕。本实验通过探讨 MT01 对小鼠单核/巨噬细胞RAW264.7内NLRP3 mRNA表达的影响，寻求可抑制NLRP3炎症小体激活的方法。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器 MT01(吉林大学基础医学院分子生物学教研室设计，TAKARA合成)，牙龈卟啉单胞菌Pg ATCC33277(中国医科大学口腔医学院中心实验室提供)，小鼠单核/巨噬细胞RAW264.7(ATCC号：TIB-71,American Type Culture Collection)，低糖DMEM培养基(Hyclone公司，美国)，胎牛血清(PAA公司，奥地利)，脑心浸萃液态培养基(BHI-S,Gibco)，6孔培养板(COSTAR，美国)，10 cm细胞培养皿(Corning公司，美国)，RNAiso Plus(Total RNA提取试剂)，反转录试剂盒，荧光定量PCR试剂盒(Takara公司，日本)，超净工作台(苏州宏瑞净化，中国)，CO2恒温细胞培养箱(SANYO 公司，日本)，倒置相差显微镜(OLYMPUS公司，日本)紫外分光光度仪(BIO-RAD 公司,美国)，M×3005P荧光定量PCR仪(Stratagene,美国)。

1.2细菌及细胞培养

1.2.1实验冻干菌株Pg ATCC33277，复苏，接种于新鲜配制的BHI液体培养基(5%无菌脱纤维羊血，5 μg/ml氯化血红素，1 μg/ml维生素K1)37℃厌氧培养5～7 d，挑单克隆菌落接种于液体培养基中培养48 h，在波长600 nm的紫外分光光度计下测细菌密度，调制备用。

1.2.2RAW264.7细胞，复苏，接种于含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 mg/L链霉素的低糖DMEM培养基中。置于5%CO2，37℃培养箱中培养生长。隔日换液，待细胞长满平皿的80%～90%，用细胞刮轻柔地将贴壁的细胞刮下，吹打混匀，按1∶2传代。

1.3人工设计合成MT01 设计合成MT01 (5′-ACC CCC TCT ACC CCC TCT ACC CCC TCT-3′)，用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至母液浓度0.1 μg/μl，-20℃保存备用。

1.4实验分组 将RAW264.7细胞以4.5×105个/孔接种于6孔板中。待12 h细胞完全贴壁后，换无血清的培养液饥饿24 h。分为Pg组、MT01组、Pg+MT01组和只加PBS的对照组。(按细菌100∶1的感染复数，MT01的工作浓度1 μg/ml分别制成不同的混合液)分别培养6 h。

1.5实时定量PCR检测NLRP3 mRNA的表达 将上述分组的细胞孵育6 h后，按Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA，各组取4 μg总RNA逆转录合成CDNA，再取逆转录产物进行实时定量PCR 的检测。引物由Takara公司设计合成，以GAPDH内参基因。GAPDH 前向:5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，反向:5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′；NLRP3 前向:5′-GAGTTCTTCGCTGCTATGT-3′，反向:5′-ACCTTCACGTCTCGGTTC-3′。实时定量PCR反应体系：引物(10 μmol)各0.5 μl，SYBR Premix Ex Taq(2×)12.5 μl，DyeII 0.5 μl，模板cDNA 2 μl，蒸馏水dH2O补足总体积至25 μl。反应条件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30～34 s，95℃延伸15 s，循环40次。利用M×3005 P荧光定量PCR仪联机软件进行Ct值相对定量分析。

1.6统计学分析 应用SPSS17.0软件进行分析，采用配对样本t检验。

2 结 果

2.1RAW264.7细胞形态学表现 倒置相差显微镜观察细胞形态以类圆形和多边形为主，并有较长的突触，一般以单核为主，少数有2个核。细胞生长较快，5～6 d可汇合。见图1。

图1 RAW264.7细胞形态学表现

2.2Pg生长形态 在BHI平板上厌氧培养5～7 d，可观察到典型的黑色菌落。

2.3MT01干预Pg感染的RAW264.7内NLRP3 mRNA的表达 与PBS对照组相比，MT01组NLRP3 mRNA表达最低(P<0.05)，Pg组NLRP3 mRNA表达最高(P<0.01)，Pg+MT01组NLRP3 mRNA表达低于Pg组，高于MT01组和PBS组(P<0.01)。

3 讨 论

NLRP3的异常调节与炎症性疾病密切相关，细菌、真菌及病毒等都可以通过组织损伤、代谢异常等导致的宿主天然免疫应答激活NLRP3〔4〕，NLRP3在天然免疫系统中具有重要的调控作用〔7〕。Bostanci等〔8〕研究表明，在牙龈炎和牙周炎患者牙龈组织中NLRP3 mRNA的表达显著高于健康组，且NLRP3 mRNA的表达与白细胞介素(IL)-1β和IL-18呈正相关。

本实验结果表明MT01对RAW264.7内NLRP3 mRNA的表达具有显著的抑制作用。已有的研究〔5〕表明，MT01能抑制由病原菌感染引起的过度有害的免疫反应，维持机体的免疫平衡，防止组织细胞受到损伤前期工作发现，MT01对大鼠牙周炎引起的牙槽骨吸收具有明显的抑制作用〔6〕，但其机制不明。本研究结果提示，MT01对大鼠牙周炎的调控作用可能是由于其对NLRP3激活的抑制作用引起。

作为目前公认的牙周炎致病菌，Pg可诱导人单核/巨噬细胞发生坏死样细胞死亡，且这一过程与NALP3有关〔9〕。本实验结果表明，Pg刺激后，巨噬细胞RAW264.7内NLRP3 mRNA的表达异常增高，说明Pg感染可导致NLRP3的激活，进而引发一系列的免疫调控反应。实验中采用MT01对Pg感染进行干预，发现MT01可显著下调Pg感染所引起的RAW264.7内NLRP3 mRNA的表达水平。

上述结果说明MT01不仅可以抑制NLRP3 的激活，而且能够抑制Pg感染所导致的NLRP3的表达，提示MT01对NLRP3活化的干预可能成为抑制牙周感染的一种策略。

4 参考文献

1Franchi L,Muoz-Planillo R,Núez G. Sensing and reacting to microbes through the inflammasomes〔J〕. Nat Immunol,2012；13(4):325-32.

2Bostanci N,Emingil G,Saygan B,etal. Expression and regulation of the NALP3 inflammasome complex in periodontal diseases〔J〕. Exp Immunol,2009；157(3):415-22.

3Hajishengallis G. Immunomicrobial pathogenesis of periodontitis:keystones,pathobionts,and host response〔J〕. Trends in Immunology,2013.

4Leemans JC,Cassel SL,Sutterwala FS. Sensing damage by the NLRP3 inflammasome〔J〕. Immunol Rev,2011；243(1):152-62.

5Yang G,Wan M,Zhang Y,etal. Inhibition of a C-rich oligodeoxynucleotide on activation of immune cells in vitro and enhancement of antibody response in mice〔J〕. Immunology,2010；131(4):501-12.

6Shen Y,Feng Z,Lin C,etal. An oligodeoxynucleotide that induces differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells to osteoblasts in vitro and reduces alveolar bone loss in rats with periodontitis〔J〕. Int J Mol Sci,2012；13(3):2877-92.

7von Moltke J,Ayres JS,Kofoed EM,etal. Recognition of bacteria by inflammasomes〔J〕. Ann Rev Immunol,2013；31:73-106.

8Bostanci N,Emingil G,Saygan B,etal. Expression and regulation of the NALP3 inflammasome complex in periodontal diseases〔J〕. Clin Exp Immunol,2009；157(3):415-22.

9Huang MTH,Taxman DJ,Holley-Guthrie EA,etal. Critical role of apoptotic speck protein containing a caspase recruitment domain (ASC) and NLRP3 in causing necrosis and ASC speck formation induced by porphyromonas gingivalis in human cells〔J〕.J Immunol,2009；182(4):2395-404.