参苓散对脾阴虚痴呆模型大鼠海马区BDNF、NGF表达的影响

侯永春 严 孜

(江西中医药大学，江西 南昌 330004)

老年性痴呆(AD)是一种中枢神经系统退行性疾病，其进行性的认知功能障碍学习和记忆能力减退〔1〕。中医发现这一病症与脾虚湿胜、脑窍失养症状相似；同时临床上也多用补脾益肾增智的方剂。参苓散具有益心力，除谬忘，能饮食，延年益寿的功效。近几年来发现大脑海马区神经因子数量减少和功能障碍在脾阴虚AD发生与发展中起到越来越重要的作用〔2〕。本研究观察参苓散对脾阴虚AD大鼠的学习记忆功能的改善作用，用免疫组化(SP)方法观察大鼠海马神经因子表达的变化，为防治脾阴虚AD病提供科学证据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 选用清洁级健康雄性SD大鼠48只，江西中医学院实验动物中心提供，合格证号2011-50，体重(300±20)g，环境温度(25±2)℃，自然昼夜节律，颗粒饲料饲养，自由饮水。

1.1.2药品与试剂 参苓散(药物包括茯苓、人参、甘草等份自配，常规水煎，药液含生药3.2 g/ml)和伤阴药(吴茱萸、附子等，常规水煎，药液含生药1 g/ml)江西南华制药有限公司；戊巴比妥钠注射液，江西科伦药业有限公司； 3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷(APES)；抗兔SP试剂盒,中性磷酸盐缓冲溶液(PBS)；二氨基联苯胺(DAB)显色剂(均为中杉金桥)。

1.1.3仪器 2135型石蜡切片机(Leica，德国)，展片、烤片机(山东红旗仪器厂，中国)，DT10K型电子天平(江苏常熟长青仪器仪表厂，中国)，恒温箱兼培养箱(上海医用恒温设备厂，中国)，BX-41型显微照相仪(OLYMOUS,日本),DB001型Morris水迷宫(北京智鼠多宝生物科技有限责任公司，中国)。

1.2方法

1.2.1动物分组 48只健康雄性大鼠称重后，随机分成四组：空白组(空白对照)、阴虚组(脾阴虚)、AD组(脾阴虚+AD)和治疗组(脾阴虚+AD+治疗)，每组12只。

1.2.2动物模型复制及给药

1.2.2.1脾阴虚证模型 首先对阴虚组、AD组和治疗组大鼠参照经典的复合因素造模法〔3〕进行脾阴虚模型的建立，分为脾气虚和脾阴虚两个阶段。实验第1～15天为脾气虚阶段，大鼠单日自由游泳达到耐力极限，禁食饲料，喂甘兰(30 g/只)；双日予猪油脂灌服；空白组正常喂养，予等量生理盐水灌服。第16～24天为脾阴虚阶段，在脾气虚的基础上每日增加伤阴药1 ml/100 g ，连续灌服。而空白组大鼠仅予等体积生理盐水灌服。

1.2.2.2脾阴虚+AD模型 AD组、治疗组大鼠继续进行AD模型〔4〕的建立， 用MILLIQ水将Aβ1～40稀释成5 μg/μl，37℃孵育1 w，使其变为聚集状态备用。大鼠经腹腔注射2%戊巴比妥钠(45 mg/kg)麻醉后，固定到脑立体定位仪，常规备皮消毒，切开皮肤；选择双侧海马为注射靶区，取前囟后3.5 mm ，中线旁2.0 m ，门齿钩平面低于耳间线平面3.3 mm 处钻开颅骨，暴露硬脑膜，微量注射器自脑表面缓慢垂直进针至硬脑膜下2.5 mm, AD各组每侧予以2 μl 淀粉样蛋白酶(Aβ1～40)溶液缓慢注入，留针以保证溶液充分弥散，缓慢撤针，缝合切口，皮下注射抗生素防止感染；空白组和阴虚组大鼠进行同样手术，仅注入等体积MILLIQ水,术后继续喂养。

1.2.3药物干预 术后第4天对治疗组大鼠给予中药参苓散灌胃，每日1 ml/100 g, 持续10 d，而其余各组大鼠每日予等体积生理盐水灌胃。

1.2.4Morris水迷宫试验 采用Morris水迷宫测试各组大鼠造模前、造模后、治疗后学习记忆能力；具体方法参照Morris等〔5〕的方法，分别于AD造模术前、造模术后第3天及治疗结束后评价各组大鼠逃避潜伏期、穿越平台的次数。

1.2.5标本制备 各组大鼠在进行行为学测试结束后，立即以致死量100 g/L水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉后，仰卧位固定于手术台上，剪开胸腔，暴露心脏，从心尖插入灌注针至左心室，同时剪开右心耳，快速滴入37℃生理盐水300 ml，无血污后改为滴入固定液4℃的多聚甲醛400 ml。待大鼠尾巴完全僵直时迅速断头，取出海马组织，固定于4%多聚甲醛溶液中12～24 h，进行脱水透明及石蜡包埋。冠状面连续切片，厚度约3 μm，用经多聚赖氨酸处理过的载玻片捞片，晾干后置于60℃的烤箱中烘烤备用。

1.2.6脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)免疫组化检测 采用免疫组化SP法检测BDNF及NGF的表达，严格按照试剂说明书操作要求进行检测。在海马区随机选择8个视野，用显微图像分析系统下的目镜，400倍显微计数，计算阳性细胞数平均数。

2 结 果

2.1定位航行试验 造模前各组大鼠定位航行试验逃避潜伏期无统计学差异(P>0.05)，具有可比性；造模后，阴虚组、AD组、治疗组与空白组对比逃避潜伏期明显延长(P<0.05或P<0.01)。给予中药参苓散灌胃后，与阴虚组、AD组相比，治疗组逃避潜伏期明显缩短(P<0.05)。见表1。

表1 造模前、后各组大鼠逃避潜伏期的比较

2.2空间探索试验 造模前各组大鼠空间探索试验穿越平台次数无统计学差异(P>0.05)，且有可比性。造模后，阴虚组、AD组、治疗组与空白组对比穿越平台次数明显减少(P<0.01)；其中治疗组、AD组与阴虚组比较，穿越平台次数明显减少(P<0.01)。给予中药参苓散灌胃后，与阴虚组、AD组相比，治疗组穿越平台次数明显增加(P<0.01)。见表2。

表2 造模前、后各组大鼠穿越平台次数的比较次，n=12)

2.3各组大鼠BDNF、NGF表达情况 与空白组比较，阴虚组、AD组大鼠海马BDNF、NGF表达明显下调(P<0.01)；而治疗组与阴虚组、AD组比较明显上调(P<0.01)。见表3、图1。

表3 各组大鼠海马组织BDNF、NGF免疫阳性神经元计数比较

图1 各组大鼠海马区BNF、NGF表达比较(×400)

3 讨 论

AD呈逐年上升的趋势，至今还没有令人满意的治疗方法，中药方治疗AD给人们提出了新思路。本研究结果表明参苓散灌服能够明显提高脾阴虚AD大鼠的学习和记忆能力，改善认知功能。

海马结构作为大脑边缘系统的重要组成部分，在学习和记忆等高级神经活动中起关键作用，海马神经元损害可能是AD的重要病理基础之一。神经营养因子是一类对神经有特异性的蛋白质，BDNF和NGF就是其中的代表。随着对其深入研究，人们发现它们具有明确的促进和维持神经细胞分化、生长和存活作用，在改善认知功能方面也有重要作用〔6～8〕。但中药方参苓散能否促进慢性脑缺血大鼠BNF的表达，目前国内外未见报道。本研究结果提示参苓散能通过启动BDNF的表达加强脑缺血后的内源性修复过程，这可能是内服参苓散后机体对脑进行保护作用的一种机制。

AD属中医学的“痴证”、“呆病”等范畴，中医学认为引起本病的基本原因是肝肾亏虚、气血不足、经脉失养、髓海不足。而脾胃为后天化生之源，脾胃气健则先天肾气充实，髓海得养。参苓散方中人参大补元气，以生中气，健脾益肺，以助运化，益智安神，以充髓海；更有茯苓协助利水渗湿，调补脾阴，益心脾而宁心安神，炙甘草益气补中，调和诸药，共奏健脾安神之功。

4 参考文献

1官志忠，齐晓岚.阿尔茨海默病的分子发病机制及其治疗研究进展〔J〕.中华病理学杂志，2008；37(1)：11-5.

2Tesseur I，Van Dorpe J，Spittaels K,etal.Expression of human apolipoprotein E4 in neurons causes hyperphosphorylation of protein tau in the brains of transgenic mice〔J〕.Am J Pathol,2000;156(3):951-64.

3王少华，李 静，耿美玉.阿尔茨海默病的炎症病理机制及糖类物质的抗炎作用〔J〕.生理科学进展,2005;36(1):67-70.

4郝小燕,周 蕾,叶 兰，等.组分中药对D-半乳糖联合Aβ1-40致痴呆模型大鼠脑组织抗氧化能力的影响〔J〕.时珍国医国药,2012;23(10):2516-7.

5Morris R, garrud P, Rawlins JN,etal. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions〔J〕. Nature，1982;297(5868):681-3.

6Amino S，Itakura M，Ohnishi H，etal. Nerve growth factor enhances neurotransmitter release from PC12 cells by increasing Ca(2+)-responsible secretory vesicles through the activation of mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol 3-kinase〔J〕. J Biochem，2002;131(6)：887-94.

7Yang JT，Chang CN，Lee TH，etal. Effect of dexamethasone on the expression of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 messenger ribonucleic acids after forebrain ischemia in the rat〔J〕．Crit Care Med，2002;30(4)：913-8.

8Hall J，Thomas KL，Everitt BJ．Rapid and selective induction of BNDF expression in the hippocampus during contextual learing．Nat Neurosci，2000;3(6)：533-5.