原发性乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞及肿瘤干细胞的检测及临床意义

王 蒙 杨 超 刘运江

(河北医科大学第四医院乳腺中心，河北 石家庄 050011)

大量临床研究证明乳腺癌是一种全身性疾病，早期即可发生淋巴、血行转移〔1〕。乳腺癌在发病初期即可以在外周血中检测到循环肿瘤细胞，可能已有潜伏的微转移。微转移是导致转移和复发的主要原因，循环肿瘤细胞(CTC)的存在与肿瘤患者复发和预后都有密切联系。肿瘤干细胞(TSC)的提出又为肿瘤早期微转移提供了新的理论基础。乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞和肿瘤干细胞的检测对于肿瘤的预防、诊断及治疗都具有重要意义〔2，3〕。研究发现，乳腺癌患者外周血中存在循环肿瘤细胞，但大部分循环肿瘤细胞在血液循环中很快会凋亡，即使到达远处器官组织也无法形成转移灶。本研究检测原发性乳腺癌患者中的CTC和TSC。

1 材料与方法

1.1临床资料 选取河北医科大学第四医院乳腺中心2010年9月至2011年2月44例初治原发性女性乳腺癌患者，均经临床检查及细胞学或组织病理学检查确诊，抽血前未经任何治疗。年龄51～67岁，临床分期Ⅰ期12例，Ⅱ期18例，Ⅲ期14例；ER阳性33例，阴性11例；PR阳性33例，阴性11例；C-erbB2阳性6例，阴性24例。另选取15例正常女性志愿者为阴性对照组。

1.2主要试剂和设备 Anti-FITC MicroBdads(德国美天旎公司)、Mouse monoclonal to Cytokeratin 19(FITC)和Rat monoclonal to CD44(FITC)(英国Abcam公司)、CD24 Antibody(FITC)(美国Novus Biologicals公司)、人中性粒细胞分离液(FICOLL)(上海易佰聚生物公司)、荧光显微镜(日本奥林巴斯 BX51T-PHD-J11) 分选架、磁铁和分选柱(德国美天旎公司)。

1.3实验方法

1.3.1外周血单个核细胞悬液(PBMC)制备 将外周血、生理盐水及人中性粒细胞分离液(FICOLL)按1∶1∶1混匀，上离心机2 500 r/min离心15 min，吸白膜层。再离心(1 500 r/min，5 min)2次，去上清。

1.3.2CK19阳性(CK19+)细胞标记和磁性分选

1.3.2.1CK19+细胞标记 将CK19-FITC和抗FITC磁珠加入分离所得单个核细胞，加入缓冲液至补足体积，每107细胞(1∶11)混匀，4～8℃避光孵育10 min。加入10～20倍标记体积的缓冲液洗涤细胞，1 000 r/min离心10 min，完全去除上清(重复洗涤1次)。每108细胞用500 μl缓冲液重悬。进行磁性分选。

1.3.2.2磁性分选 将MS分选柱放置在适当MACS分选器的磁场中，用500 μl缓冲液润湿分选柱，将磁性标记后的细胞加入分选柱上，进行细胞分选。收集先行流出的未标记细胞，用适量缓冲液冲洗分选柱。在分选柱下放置适当的采集管，在分选柱内加入缓冲液，用分选柱配备的活塞迅速推出磁性标记细胞。

1.3.2.3阳性细胞制片、图像采集 将磁性分选所得阳性细胞离心(1 500 r/min，5 min)，去上清，10 μl PBS混匀，离心涂片(1 000 r/min，2 min)，在荧光显微镜下按临床组织病理学观察方法扫描完整的细胞涂片视野，计数阳性细胞总数，选取单个视野最多的阳性细胞进行采图、保存。采图后的涂片，使用1%甲醇室温固定15 min。4℃保存5 d。

1.3.3CD44+/CD24-/low细胞检测 涂片上滴加CD44-FITC抗体，37℃，30 min，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min。涂片上滴加CD24-FITC抗体，37℃，30 min，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min。在荧光显微镜下按临床组织病理学观察方法扫描完整的细胞涂片视野，记阳性细胞总数。选取单个视野最多的阳性细胞进行采图、保存。

1.4其他检测指标及方法 所得细胞计数根据TNM分期、ER、PR、C-erbB2、Ki-67、分子分型等进行分析。TNM分期根据2003年WHO乳腺癌TNM分期作为标准；ER、PR、Ki-67根据免疫组织化学检测所得结果为标准；C-erbB2根据免疫组织化学检测结果及Fish检测结果为标准。

1.5统计学方法 应用SPSS13.0统计软件行χ2检验。

2 结 果

2.1两组PBMC检测结果 15例正常女性志愿者PBMC中未检测到CK19+细胞，44例原发性乳腺癌患者33例(75.00%)患者PBMC中检测到CK19+细胞(图1)。两组比较具有统计学意义(P<0.05)。

图1 CK19阳性细胞 图2 CD44+/CD24-/low细胞 图3 CD24+细胞

2.2不同病理分期CK19+细胞检测结果 Ⅰ期患者12例，5例外周血中检测到CK19+细胞(41.67%)；Ⅱ期患者18例，15例外周血中检测到CK19+细胞(83.33%)；Ⅲ期患者14例，13例外周血中检测到CK19+细胞(92.86%)。χ2检验具有统计学意义(P<0.05)。

2.3不同淋巴结转移层次CK19+细胞检测结果 N024例，15例检测到CK19+细胞(62.50%)；N1-320例，18例检测到CK19阳性细胞(90.00%)。χ2检验具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.4CD44+/CD24-/low、CD29+细胞检测结果 33例CK19+样本中21例(63.63%)检测到CD44+/CD24-/low细胞，CD24+细胞所示(见图2、图3)。按临床病理分期分为3组：Ⅰ期患者2例检测到CD44+/CD24-/low细胞(2/5,40.00%)；Ⅱ期患者10例检测到CD44+/CD24-/low细胞(10/15,66.67%)；Ⅲ期患者9例检测到CD44+/CD24-/low细胞(9/13,69.23%)。χ2检验不具有统计学意义(P>0.05)。

表1 不同临床分期原发性乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞(CTC)比较

2.5不同临床特征中CK19阳性率比较 ER阳性样本33例，24例检测到CK19+细胞(72.73%)，15例检测到CD44+/CD24-/low细胞(15/24，62.50%)；ER阴性样本11例，9例检测到CK19+细胞(81.82%)，6例检测到CD44+/CD24-/low细胞(6/9，66.67%)。χ2检验不具有统计学意义(P>0.05)。C-erbB2阳性样本6例，4例检测到CK19阳性细胞(66.67%)，2例检测到CD44+/CD24-/low细胞(2/4，50.00%)；C-erbB2阴性样本24例，16例检测到CK19阳性细胞(66.67%)，11例检测到CD44+/CD24-/low细胞(11/16，68.75%)。χ2检验不具有统计学意义(P>0.05)。可见脉管瘤栓样本13例，9例检测到CK19阳性细胞(69.23%)，8例检测到CD44+/CD24-/low细胞(8/9，88.89%)；未见脉管瘤栓样本31例，24例检测到CK19阳性细胞(77.42%)，13例检测到CD44+/CD24-/low细胞(13/24，54.17%)。χ2检验不具有统计学意义(P>0.05)。

2.6根据分子亚型分组结果比较 将样本分为三型：三阴乳腺癌(ER、PR阴性，C-erbB2经FISH法检测阴性)、ER阳性(ER和/或PR阳性)、C-erbB2阳性(ER、PR阴性，C-erbB2经FISH法检测阳性)。三阴样本5例，5例检测到CK19+细胞(100.00%)，4例检测到CD44+/CD24-/low细胞(4/5，80.00%)；ER阳性样本19例，11例检测到CK19+细胞(57.89%)，7例检测到CD44+/CD24-/low细胞(7/11，63.64%)；C-erbB2阳性样本4例，3例检测到CK19+细胞(75.00%)，2例检测到CD44+/CD24-/low细胞(2/3，66.67%)。χ2检验不具有统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

CTC是分析恶性肿瘤生物学特性和转移行为的一个有效窗口〔4〕。大部分肿瘤细胞处于不增殖或有限增殖状态，但肿瘤干细胞具有更强的转移侵袭能力〔5〕，原发性乳腺癌患者外周血中循环肿瘤细胞(CTC)的出现与临床分期、淋巴结转移及预后有着密切的联系〔6～8〕，国内任传利等〔8〕建立EpCAM抗体耦联纳米磁珠阳性分离乳腺癌等实体肿瘤中CTC检出率均不低于50%，而且随着肿瘤分期增加，CTC检出率显示出增加的趋势，外周血中CTC的出现意味着早期微转移的存在。但循环肿瘤细胞(CTC)的存在不一定意味着转移灶的形成，Al-Hajj等〔9〕研究显示乳腺癌细胞中有一群表型为CD44+/CD24-/low的细胞具有肿瘤干细胞特征，首先证实了乳腺癌肿瘤干细胞的存在。肿瘤干细胞(TSC)学说认为，大部分循环肿瘤细胞并不具有分化增殖能力或具有有限增殖能力，只有一部分肿瘤干细胞是肿瘤发生、发展的重要因素〔8〕。只有肿瘤干细胞具有瘤形成能力，才能够到达远处组织器官形成转移灶，因此检测外周血中肿瘤干细胞的存在更具有临床意义。

细胞角蛋白(CK)是检测乳腺癌的一个特异性较高的标记物，CK19是最常见的角蛋白之一，在肿瘤细胞中含量丰富〔9〕。本实验表明循环肿瘤细胞的阳性率与临床分期、淋巴结转移等密切相关。临床分期越晚，循环肿瘤细胞的阳性率越高，Ⅰ期患者的外周血中亦检测到CK19+细胞，表明在乳腺癌发病的初期外周血中即已经存在循环肿瘤细胞。ER阴性的样本中，CK19细胞的阳性率在ER阳性样本、C-erbB2阳性、Ki-67高表达和三阴性乳腺癌样本中均较高，表明循环肿瘤细胞的阳性率与ER、C-erbB2、Ki-67、分子分型等有着密切联系。

以CD44+/CD24-/low细胞作为外周血循环肿瘤细胞的干细胞标志〔9〕。CK19+细胞中CD44+/CD24-/low细胞的检测采用免疫荧光双染色。33例CK19+细胞样本中21例检测到CD44+/CD24-/low细胞(63.63%)。可见外周血微转移与肿瘤干细胞有着密切联系，且肿瘤干细胞对于外周血微转移的出现起着重要的作用。临床分期越晚，肿瘤干细胞出现的数量越多，TSC所占CSC的比例越高。本实验Ⅰ期患者的外周血中亦检测到CD44+/CD24-/low细胞，说明在乳腺癌发病的初期已经是全身性疾病，已经可能有潜在微转移的存在。循环肿瘤细胞的存在并不一定意味着肿瘤干细胞的存在，表明循环肿瘤细胞在外周血中大部分趋于凋亡，而肿瘤干细胞由于具有干细胞特性而在外周血中免于凋亡。有研究表明骨髓中存在弥散肿瘤细胞(DTC)的样本中均可以检测到肿瘤干细胞，且比例高达72%〔10〕，表明外周血中的非肿瘤干细胞趋于凋亡，只有具有干细胞特性的肿瘤干细胞能够进入骨髓。

4 参考文献

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