氯化锂对人神经母细胞瘤细胞氧糖剥夺模型PARP/AIF凋亡信号通路的影响

贾国强 付宝莲 巴晓红

(建昌县人民医院，辽宁 建昌 125300)

氯化锂对氧糖剥夺的SH-SY5Y细胞具有较强的保护作用，1.0 mmol/L氯化锂为细胞保护的有效剂量，其作用机制之一可能是对 AIF信号通路的抑制〔1〕。本实验拟采用氧糖剥夺的SH-SY5Y细胞模型模拟脑缺血再灌注损伤进一步阐述氯化锂对PARP-1/AIF信号通路的影响，为锂剂用于缺血性脑血管病的治疗奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1主要仪器设备 二氧化碳(CO2)培养箱；低温高速离心机；BB6220型三气培养箱；倒置相差显微镜；显微照相系统；超净工作台；BIO-RAD电泳槽；BIO-RAD半干转印仪。

1.2主要试剂 氯化锂(Sigma)、兔抗人AIF单克隆抗体(abcam)、TRITC标记的山羊抗兔IgG二抗(Santa cruz)、兔抗人PARP-1单克隆抗体(Abcam)、小鼠抗人β-actin单抗(Santa cruz)、辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG (Santa cruz)、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG (Santa cruz)、兔抗组蛋白H1多克隆抗体(Santa cruz)、DMEM培养液(Hyclone)、胎牛血清(Hyclone)、BCA蛋白定量试剂盒及细胞核蛋白与细胞质蛋白抽提试剂盒(碧云天生物科技公司)，TUNEL细胞凋亡(显色法)检测试剂盒(生研生物科技有限公司)。

1.3细胞 人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞(中国医科大学附属盛京医院神经内科王占强惠赠)。

1.4实验方法

1.4.1细胞培养及氧糖剥夺模型的制备 取一管冻存的SH-SY5Y细胞，复苏，离心，加入10%胎牛血清的DMEM培养液，于37℃、5% CO2的培养箱中培养2～3 d，细胞长满单层，传代。模型制备：更换培养液为无血清、无糖人工脑脊液，置入恒温(37℃)三气培养箱，连续充以无氧气体(90% N2, 9% CO2和1% O2)。继续培养4 h取出，更换原培养液，在常氧下继续培养24 h。

1.4.2细胞分组 取传代后培养2 d的SH-SY5Y细胞分为正常对照组，氧糖剥夺组和锂剂处理组。正常对照组细胞一直置于37℃，5%饱和湿度CO2培养箱内培养。氧糖剥夺组更换nACSF，培养30 min后，造模。锂剂处理组在造模前nACSF中加入1.0 mmol/L的锂剂进行预处理。

1.4.3TUNEL染色(显色法)检测细胞凋亡 按TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(生研生物科技有限公司)说明进行操作。每张切片随机选400倍下3个视野,进行双盲观测,计算平均阳性率作为该标本的阳性率。

1.4.4Western印迹检测PARP-1、AIF蛋白的表达 取各组细胞，按照细胞核蛋白与细胞质蛋白抽提试剂盒(碧云天生物科技公司)说明书操作，提取胞浆蛋白、胞核蛋白。然后按照BCA蛋白定量试剂盒(碧云天生物科技公司)说明书操作进行蛋白浓度测定，分别取等量蛋白质进行10%SDS-PAGE电泳分离，分离后的蛋白质转移至PVDF 膜；膜经5%脱脂奶粉封闭，加入一抗(分别为1∶500稀释的兔抗人AIF单抗、兔抗组蛋白H1单抗、兔抗人PARP-1单抗，小鼠抗人β-actin单抗)，4℃过夜；加入辣根过氧化物酶标记的二抗(分别为羊抗兔IgG、羊抗小鼠IgG)，室温孵育 1 h，用DAB显色。以β-actin与Histone分别作为细胞质与细胞核的内参照进行校正，凝胶成像分析系统分析扫描结果：测定蛋白条带的积分光密度。目的蛋白相对量=目的蛋白条带积分光密度/内参蛋白条带积分光密度。

2 结 果

2.1TUNEL染色检测细胞凋亡 正常对照组:有少量TUNEL阳性细胞(1.80±0.82)。氧糖剥夺组TUNEL阳性细胞数较正常对照组明显增多(16.40±2.30,P<0.05)。锂剂处理组TUNEL阳性细胞数较氧糖剥夺组明显减少(6.52±1.86,P<0.05)，见图1。

2.2Western 印迹检测PARP-1、AIF蛋白的表达 SH-SY5Y细胞氧糖剥夺前后，胞质内PARP-1 p85片段没有表达，胞质内AIF蛋白表达无差异。而在胞核中，正常对照组中PARP-1 p85片段呈低表达，AIF蛋白低表达或不表达，细胞氧糖剥夺后PARP-1 p85片段、AIF蛋白高表达，且锂剂处理组PARP-1 p85片段、AIF条带的表达比氧糖剥夺组少，见表1、图2、图3。

表1 不同组PARP-1 p85片段、AIF蛋白印迹密度(OD)比较

图1 不同组细胞TUNEL染色阳性表达(×400)

图2 各组细胞质内蛋白Western印迹表达

图3 各组细胞核内蛋白Western印迹表达

3 讨 论

本研究表明氯化锂对氧糖剥夺模型的神经细胞有较强的保护作用。研究表明，这种保护作用可能是通过抑制AIF核移位实现的〔1〕。但是造成这种核移位的原因可能是通过激活PARP-1所造成的。

PARP-1是一种核染色质伴随蛋白，广泛存在于真核细胞内。PARP-1是caspase-3底物之一，caspase-3可将PARP-1裂解为85 kD和24 kD片段，丧失了DNA的修复作用，故出现PARP-1的裂解片段，被认为是发生细胞凋亡的一个早期标志〔2〕。脑缺血后予数天连续抑制PARP-1表达，可通过抑制炎症反应而延长受损神经元细胞存活并能促进神经再生〔3〕。AIF的释放与PARP-1有关〔4，5〕。Zhang等〔6〕体外实验得出PARP-1抑制剂可阻止AIF核移位。PARP-1基因敲除同样可抑制AIF的移位。因此认为PARP-1是AIF从线粒体释放的上游诱导因子。研究发现PARP-1与AIF依赖的细胞凋亡可能涉及p53基因、Bax和钙蛋白酶，但不包括半胱氨酸蛋白酶和PARP-2〔7〕。

AIF定位于线粒体，细胞质内AIF主要反应线粒体的AIF的表达量。而细胞核内的PARP-1 p85片段在各组细胞中均有表达，氧糖剥夺前较氧糖剥夺后表达增强，而锂剂处理组较氧糖剥夺组表达减少，说明氧糖剥夺激活了PARP-1，而AIF蛋白在正常对照组中呈低表达或不表达，在氧糖剥夺组、锂剂处理组中呈高表达，但锂剂处理组较氧糖剥夺组表达的明显减少，说明氯化锂通过激活PARP-1，从而抑制 AIF从线粒体向细胞核移位，产生抗凋亡的作用。

但是PARP-1的激活是怎么促使AIF发生核移位的，至今学界内没有明确的解释。正常情况下，PARP-1起到修复DNA作用和维持基因组的稳定性〔8〕，但如果PARP-1过度活化可导致ATP和 NAD+不可逆的衰竭〔9〕，线粒体是体内产生能量的主要场所，大量的ATP消耗，导致线粒体膜通透性发生改变，AIF从线粒体被释放出来，转移到细胞核，启动凋亡的发生。AIF引起染色体核周边凝集和DNA成大片段的断裂〔10〕，造成PARP-1不能及时的修复，加重细胞的损害，恶性循环，最终细胞发生坏死。但现在更多证据表明单纯的能量消耗不足以介导PARP-1依赖性细胞死亡。在PARP-1敲除小鼠上行缺血性卒中模型研究发现予维持细胞内能量水平，并不是减小脑梗死体积的机制。另外，用原代细胞培养技术研究发现，削弱细胞内能量水平不是PARP-1介导的细胞死亡的主要原因〔11〕。PARP-1过度激活后，大量的PAR形成对细胞有直接毒性作用〔12〕。另外，有可能通过亚细胞器等其他的途径引起的。

综上，氯化锂对氧糖剥夺模型的SH-SY5Y细胞具有较强的保护作用，其作用机制之一可能是通过抑制PARP-1活性，从而减少AIF发生核移位。

4 参考文献

1贾国强, 巴晓红, 潘凤英.锂剂对SH-SY5Y细胞氧糖剥夺模型的保护作用及其对AIF凋亡通路的影响〔J〕.中风与神经疾病杂志，2011；28(3): 228-32.

2Lazebnik YA, Kaufmann SH, Desnoyers S,etal.Cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase by a proteinase with properties like ICE〔J〕.Nature, 1994；371(6495): 346-7.

3Kauppinen TM, Suh SW, Berman AE,etal.Inhibition of poly(ADP-ribose) polymerase suppresses inflammation and promotes recovery after ischemic injury〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab，2009；29(4): 820-9.

4Yu SW, Andrabi SA, Wang H,etal.Apoptosis-inducing factor mediates poly (ADP-ribose) (PAR) polymer-induced cell death〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA, 2006；103(48): 18314-9.

5Andrabi SA, Kim NS, Yu SW,etal.Poly(ADP-ribose)(PAR) polymer is a death signal〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA, 2006；103(48): 18308-13.

6Zhang Y, Zhang X, Park TS,etal.Cerebral endothelial cell apoptosis after ischemia-reperfusion: role of PARP activation and AIF translocation〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab, 2005；25(7): 868-77.

7Moubarak RS, Yuste VJ, Artus C,etal.Sequential activation of poly(ADP-ribose) polymerase 1, calpains, and Bax is essential in apoptosis-inducing factor-mediated programmed necrosis〔J〕.Mol Cell Biol, 2007；27(13): 4844-62.

8Masutani M, Suzuki H, Kamad N,etal.Poly(ADP-ribose) polymerase gene disruption conferred mice resistant to streptozotocin-induced diabetes〔J〕.Proe Natl Aead Sci USA，1999；96(5):2301-4.

9Nguewa PA, Fuertes MA, Valladares B,etal.Poly(ADP-ribose) Polymerases: homology, structural domains and functions.Novel therapeutical applications〔J〕.Prog Biophys Mol Biol，2005；88(1):143-72.

10Yu SW, Andrabi SA, Wang H,etal.Apoptosis-inducing factor mediates poly (ADP-ribose) (PAR) polymer-induced cell death〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA, 2006；103(48): 18314-9.

11Wang Y, Dawson VL, Dawson TM.Poly(ADP-ribose) signals to mitochondrial AIF: a key event in parthanatos〔J〕.Exp Neurol，2009；218(2): 193-202.

12Szabo G, Bahrle S, Stumpf N,etal.Poly(ADP-Ribose) polymerase inhibition reduces reperfusion injury after heart transplantation〔J〕.Circ Res,2002；90(1): 100-6.