白藜芦醇诱导肺腺癌A549细胞凋亡的机制

刘焕义 赵 煜 张小龙 徐红玉 苏小妹 杨 波

(成都军区总医院肿瘤科,四川 成都 610083)

在许多植物中都发现有白藜芦醇(Res)，其可以抑制癌细胞生长，有关Res抑制肺腺癌A549细胞生长作用的报道较少，对其抗肿瘤的确切机制亦不清楚。本研究拟探讨Res诱导肺腺癌A549细胞凋亡的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 低分化肺腺癌A549细胞由美国Rockville研究所提供，培养于含10%胎牛血清，青-链霉素(各100 U/ml)的DMEM培养基中，置37℃ 、饱和湿度、5% CO2培养箱孵育培养。Res购于Sigma公司，用DMSO溶解后保存于-20℃。

1.2Res作用于A549细胞后形态学观察 将处于对数生长期的A549细胞接种于培养皿中，待细胞长至约80%融合时，分别加入终浓度为25、50、100、200 μmol/L的Res ,同时设DMSO对照组，作用24 h后在倒置相差显微镜下观察细胞形态学变化。

1.34,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)细胞核荧光染色 将处于对数生长期的细胞接种于6孔板中，同步化细胞24 h后，加药处理24 h，常规收集细胞，弃上清后用80%酒精固定30 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤1次，离心，留取少量上清，加入DAPI染色5 min后，再用PBS洗2次，离心去上清，加入适量PBS吹悬，取20 μl滴于载玻片上，中性树脂封片，荧光显微镜观察。

1.4MTT法检测细胞增殖活性 将处于对数生长期的A549细胞悬液调整为1×105/L接种于96孔培养板，100 μl/孔，置于37℃、5%CO2培养箱培养。待细胞贴壁，去除培养基，再加入含不同浓度(0、25、50、100、200 μmol/L)Res的培养基，每组设6个平行孔，同时设置DMSO对照组置于37℃、5%CO2培养箱培养24 h后每孔加入MTT溶液20 μl,37℃、5%CO2培养箱继续培养4 h，小心吸弃孔内培养基，加入DMSO 150 μl/孔,室温避光振荡15 min，使结晶充分溶解，于酶联免疫检测仪490 nm处检测吸光度数值(OD值)。细胞增殖抑制率(%)=(1-实验孔OD值/6×对照孔OD值)。

1.5Western 印迹检测凋亡蛋白变化情况 弃去细胞培养液，PBS洗涤细胞3次，细胞刮刀将细胞刮下，离心，加入细胞裂解液〔(10 mmol/L Tris-HCl(pH7.4),150 mmol/L NaCl,0.1%(SDS),100 μg/ml PMSF,0.5%NP-40,0.5%脱氧胆酸钠〕，4℃冰浴中超声破碎细胞，4℃放置待细胞膜破碎，反复斡旋后于4℃ 12 000 r/min离心，取上清，蛋白定量后，样品经SDS-聚丙烯酰氨凝胶(PAGE)分离，蛋白电转至聚氧偏乙烯(PVDF)膜。将PVDF膜在10%牛奶中封闭1 h，加入1∶1 000的一抗，4℃温育过夜，洗涤，加入酶标二抗室温1 h，PVDF膜经化学发光法(ECL)检测特异蛋白。

1.6统计学方法 应用SPSS13.0软件进行单因素分析。

2 结 果

2.1细胞形态学观察 Res作用肺腺癌A549细胞24 h后，在倒置显微镜下直接观察，发现一些细胞形态改变，低浓度Res作用时细胞体积有所增大，但细胞数减少；当增加Res浓度至200 μmol/L时，大量细胞凋亡，呈现为细胞大量漂浮，细胞间隙明显增大。见图1。

图1 Res作用于A549细胞的形态学变化(×200)

2.2DAPI细胞核荧光染色观察 DAPI是一种DNA特异性染料，与DNA发生嵌入式结合，发出蓝色荧光。凋亡细胞的细胞核裂比较明显，且发生核边缘不规则、核小体核碎片增加。Res可以诱导肺腺癌A549细胞凋亡，随着加入Res浓度增加凋亡越明显，而对照组细胞的细胞核完好无损。见图2。

2.3MTT检测Res对肺腺癌A549细胞的细胞毒性 分别给A549细胞加入不同浓度Res(0、25、50、100、200 μmol/L)后，计算出抑制率分别为0%、12.4%、21.6%、51.3%、89.7%，经软件分析 IC50为 100 μmol/L。

2.4凋亡蛋白的检测 用0、25、50、100、200 μmol/L Res处理A549细胞24 h后，P53、Bax、Cleaved-Caspase3表达明显上调，而Bcl-2表达量下降，而且Bcl-2/Bax的比值明显下降。见图3。

图2 荧光显微镜观察Res作用24 h后A549细胞核的形态变化(×1 000)

图3 不同浓度Res作用A549细胞24 h后，P53、Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase3蛋白表达的Western印迹结果

3 讨 论

早期研究表明，Res能通过降低血液中胆固醇、抑制脂质过氧化而减少动脉粥样硬化、高脂血症的发生，抑制血小板聚集从而阻止血栓的形成。之后的研究又发现，Res具有抗肿瘤特性，可以抑制人乳腺癌细胞、前列腺癌细胞和急性早幼粒白血病细胞的增殖〔1～5〕。本实验研究结果提示，Res能够引起A549细胞形态学变化，明显抑制细胞的增殖。不同浓度Res作用后，A549细胞体积缩小，细胞的折光性减弱，且随着Res浓度的增加，细胞形态变化越明显，对细胞的抑制率也明显增加。

抑癌基因P53作为多种细胞应激与细胞应答的中间环节，与其上下游的各种调控因子及相关基因共同构成了一个错综复杂的信号通路。P53肩负着介导细胞周期阻滞、促进细胞凋亡、维持基因组稳定、抑制肿瘤血管发生等多种功能使命，在整个机体组织细胞的生长、发育、分化过程中起着举足轻重的作用〔6，7〕。P53不仅可以通过下游基因CyclinB1、14-3-3、GADD45、b99等参与细胞周期阻滞，还可以促进细胞凋亡〔8〕。当DNA损伤过度无法修复时，P53则诱导细胞发生凋亡以清除损伤细胞，其中一种机制为上调凋亡促进因子Bax的表达，下调凋亡抑制因子Bcl-2的表达而实现其促进凋亡作用〔9〕。本实验结果显示，Res作用A549细胞后，P53表达量增加，并下调Bcl-2蛋白和上调Bax蛋白的表达来诱导细胞凋亡。Bcl-2/Bax的比值降低，增加了线粒体膜的通透性和细胞色素C的释放，导致促凋亡基因Caspase3活性增加，启动细胞内凋亡程序。本实验中Res作用A549细胞后，Cleaved-Caspase3激活,Res浓度越高激活越明显。Caspase3家族属于天冬氨酸蛋白酶，在介导细胞凋亡过程中起着非常重要的作用，其中Caspase3为关键的效应分子，它可催化多种细胞内特异蛋白的激活，在凋亡信号转导的许多途径中发挥着重要功能〔10,11〕。

综上，本实验认为Res是一个有广泛应用前景的抗癌新药，其抑制肿瘤细胞生长是治疗肺癌的重要机制。

4 参考文献

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3郭慧琳,张献全.白藜芦醇与乳腺癌相关研究进展〔J〕.重庆医学,2013;42(6):703-4,18.

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7Lee HE,Han N,Kim MA,etal.DNA damage response-related proteins in gastric cancer: aTM,chk2 and p53 expression and their prognostic value〔J〕.Pathobiology,2013;81(1):25-35.

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9Renton A,Llanos S,Lu X.Hypoxia induces p53 through a pathway distinct from most DNA-damaging and stress-inducing agents〔J〕.Carcinogenesis,2003;24(7):1177-82.

10李鸿茹,陈愉生,陈 刚,等.Livin在肺癌中的表达及与pro-caspase3的相关性分析初步探讨〔J〕.中国肺癌杂志,2008;11(5):729-33.

11李 铭,廖 红,程恒辉,等.苦参素对人肺癌A549细胞增殖及caspase3/7蛋白活性的影响〔J〕.细胞与分子免疫学杂志,2013;29(5):498-9.