雌二醇对冈田酸诱导的SH-SY5Y细胞tau蛋白磷酸化的影响

李凯军 胡江平

(牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011)

过度磷酸化的tau蛋白与阿尔茨海默病(AD)的形成和发展有着密切的联系〔1〕。冈田酸(OA)是一种蛋白磷酸酯酶抑制剂，能抑制磷酸酯酶的活性，使蛋白高度磷酸化，并可以引起氧化损伤，在离体培养的海马神经元中能够诱导tau蛋白过度磷酸化；同时，OA在体内能促进Aβ沉积，造成神经元退化，突触缺失及记忆障碍，产生类AD样病理特征。雌激素(E2)在AD的发生、发展及预后中起到十分重要的作用。E2可通过多种方式发挥其对AD的保护作用，如促进神经突触生长和重塑、参与中枢神经递质的调节、减少β淀粉样蛋白(Aβ)的沉积、抗氧化和抗自由基作用、维持胞内钙的平衡、调节载脂蛋白E(ApoE)的表达等，但对细胞tau蛋白磷酸化的影响尚未见报道。绝经后妇女AD的发病率较同年龄组的男性高2～3倍，由于女性绝经后雌激素水平急剧降低，而同龄男性产生的睾丸酮在脑内经P-450芳香化酶作用可转变成雌激素〔2〕。流行病学研究亦证实AD的发病与绝经后妇女丧失雌激素的保护作用有关〔3〕。本研究观察E2对OA诱导的SH-SY5Y细胞tau蛋白磷酸化的影响。

1 材料与方法

1.1材料 人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，小鼠抗p-tau (Thr231) 购自美国Invitrogen公司，小鼠抗GAPDH抗体购自Kangchen公司，PVDF膜购自美国Millpore公司，蛋白Marker购自NEB公司，ECL试剂盒购自美国Pierce公司，OA购自美国Santa cruz公司，四甲基偶氮唑盐(MTT)购自美国Sigma公司，胎牛血清购自美国Invitrogen公司，DMEM培养基购自美国Invitrogen公司，多聚赖氨酸购自武汉博士德生物公司，DMSO购自美国Sigma公司，胰蛋白酶购自美国Invitrogen公司，其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2实验分组 常规细胞培养后，分为六组，V为空白对照组，C为OA处理组，T1、T2、T3、T4分别为10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L OA+E2处理组。SH-SY5Y细胞经40 mmol/L OA处理12 h后，加入不同浓度的E2(T1，T2，T3，T4分别为10 nmol/L,100 nmol/L,1 μmol/L,10 μmol/L)作用6 h，提取细胞蛋白，检测总tau和p-tau在Thr231位点的表达水平。

1.3细胞培养 10%胎牛血清的DMEM培养液，CO2培养箱中37℃，5% CO2，100%湿度静置培养。

1.4MTT测定 细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成单细胞悬液，每孔100 μl接种于96孔培养板，移入培养箱，待细胞完全贴壁后，每孔加入含有OA的培养液，浓度分别为10，20，40，80，160 nmol/L，对照组加等体积的培养液。每种浓度6个复孔，培养12 h后，每孔加入MTT(5 mg/ml) 20 μl，继续孵育3 h，弃上清，每孔加DMSO 150 μl，在水平摇床上震荡10 min，使结晶物充分溶解，酶标仪测定光密度值(490 nm)。

1.5Western印迹检测 收集细胞后提取蛋白、测定浓度，经灌胶、加样、电泳、转膜、封闭、一抗及二抗孵育后，应用HRP-ECL发光法检测蛋白，用BIO-RAD凝胶电泳图像分析仪进行图像采集，Quantity One软件进行图像分析。

2 结 果

2.1OA对SH-SY5Y细胞活力的影响 SH-SY5Y细胞经不同浓度OA处理12 h后，测定OD值，以正常对照组细胞活力为100%，其余各组OD值与之相比得到各自的细胞活力。我们选择细胞活力在80%以上的药物浓度处理细胞。10、20、40、80、160 nmol/L OA组细胞活力为(92.57%±13.95%)(87.48%±14.58%)(80.48%±11.93%)(60.58%±5.69%)(45.42%±4.36%)。当OA浓度大于40 nmol/L时，细胞活力受到明显的抑制，且随着OA浓度的增加而增强，而低于此浓度的OA对细胞活力没有明显的影响。

2.2E2对OA处理的SH-SY5Y细胞tau蛋白磷酸化的影响 Western印迹结果显示，C与V组相比，tau蛋白磷酸化的水平明显增加(185.41%±8.06% vs 100%±5.92%,P<0.05)，而T1、T2、T3、T4组tau蛋白磷酸化水平都明显降低〔(141.91±3.73)%、(116.63±6.55)%、(110.04±6.32)%、(94.58±6.21)%〕。T4组的tau蛋白磷酸化水平与C组相比降低了90.8%(P<0.05)，与V组水平无明显差异，光密度值以GAPDH作为内参校正。见图1。

图1 E2对OA处理的SH-SY5Y细胞tau蛋白磷酸化的影响

3 讨 论

Tau蛋白的正常功能是促进微管蛋白组成微管，并维持微管的稳定性。微管参与维持细胞形态、信息传递、细胞分裂等重要生物学过程，AD的重要病理变化之一是神经细胞内的神经原纤维缠结，其主要成分就是过度磷酸化的tau蛋白〔4〕，在AD脑组织中，异常过度磷酸化的tau蛋白含量显著增高，并聚集成双螺旋细丝(PHFs)，tau磷酸化程度的增加使tau结合微管的能力下降，从而丧失了促进微管组装的生物活性，导致细胞骨架的结构异常和神经细胞死亡。AD患者脑的tau蛋白异常过度磷酸化，每分子tau蛋白可含5～9个磷酸基，目前发现，AD患者有21个异常磷酸位点,多个磷酸位点的磷酸化更易导致tau蛋白的微管结合功能丧失,其中研究较多的有181、199、231、396及404等多个磷酸化位点,已在AD患者的脑脊液中检测到高浓度上述位点的p-tau蛋白,并具有较高的特异性和敏感性,因此，本实验选取Thr231位点进行检测。

OA是一种海洋生物提取物，对蛋白磷酸酶PP2A和PP1具有抑制作用，从而阻止tau蛋白的去磷酸化〔5〕，OA能使神经元微管相关蛋白tau异常过度磷酸化，产生神经毒性，包括产生AD样的病理过程。因此我们选用它来制造AD时tau蛋白过度磷酸化的细胞模型。MTT表明OA浓度大于40 nmol/L时，细胞活力受到明显的抑制，因此选择40 mmol/L OA处理12 h作为制备AD时tau蛋白过度磷酸化的细胞模型时OA最佳作用浓度和作用时间。

雌激素是类固醇类激素，它主要是由性腺产生，包括体内有雌二醇(E2)、雌三醇(E3)和雌酮(E1)3种类型。其中E2的生物活性最强，AD患者脑中的类固醇激素水平，与比正常人相比普遍降低，并发现神经类固醇激素的含量与AD的两大生物化学特征显著相关〔6〕，即与过度磷酸化tau蛋白(形成PHF-tau)和β淀粉样肽相关。雌激素的长期缺乏将影响神经功能，与AD的发生、发展密切相关，Twist等〔7〕用放免法对照测定AD病人和正常老年人脑中E2的含量，发现正常男性脑中的E2的量比正常女性高3.5倍，而AD患者中男女E2的比例没有明显的不同。对大量人群的回顾性及前瞻性研究和体外实验表明，雌激素替代疗法(ERT)不仅对AD的治疗有效，而且能预防AD的发病和推迟发病年龄〔8〕。

本实验表明E2对tau蛋白磷酸化有明显的抑制作用，说明E2对AD的治疗具有积极的作用，其机制很可能是通过减少tau蛋白磷酸化水平而发挥作用的。

4 参考文献

1Hu JP，Xie JW，Wang CY,etal.Valproate reduces tau phosphorylation via cyclin-dependent kinase 5 and glycogen synthase kinase 3 signaling pathways〔J〕.Brain Res Bull，2010；85(3-4)：194-200.

2Lahiri DK.′Current Alzheimer Research′：update on lipids，estrogen，neurotrophins and their roles in neurodegeneration〔J〕.Curr Alzheimer Res，2008；5(1)：1-3.

3Waring SC，Rocca WA，Petersen RC,etal.Postmenopausal estrogen replacement therapy and risk of AD：a population-based study〔J〕.Neurology，1999；52(5)：965-70.

4Grundke-Iqbal I，Iqbal K，Tung YC,etal.Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，1986；83(13)：4913-17.

5Planel E，Yasutake K，Fujita SC,etal.Inhibition of protein phosphatase 2A overrides tau protein kinase I/glycogen synthase kinase 3 beta and cyclin-dependent kinase 5 inhibition and results in tau hyperphosphorylation in the hippocampus of starved mouse〔J〕.J Biol Chem，2001；276(36)：34298-306.

6Rosario ER,Carroll J，Pike CJ.Testosterone regulation of Alzheimer-like neuropathology in male 3xTg-AD mice involves both estrogen and androgen pathways〔J〕.Brain Res，2010；1359：281-90.

7Twist SJ,Taylor GA，Weddell A,etal.Brain oestradiol and testosterone levels in Alzheimer′s disease〔J〕.Neurosci Lett，2000；286(1)：1-4.

8Ohkura T，Isse K，Akazawa K,etal.Evaluation of estrogen treatment in female patients with dementia of the Alzheimer type〔J〕.Endocr J，1994；41(4)：361-71.