老年女性原发乳腺浸润性导管癌中FoxP3表达与淋巴结转移的相关性

任伟民 张友元 董军明 罗金芳 贺国庆 顾立新

(复旦大学附属金山医院病理科，上海 201508)

乳腺癌尤其是浸润性导管癌是老年女性常见的恶性肿瘤之一〔1〕，发生转移的乳腺癌预后相对较差，治疗效果不够满意。叉头状转录因子3(FoxP3)是调节性T淋巴细胞(Treg)的特异性标记之一〔2〕，后者与乳腺癌密切相关，同时FoxP3作为转录因子本身亦发挥重要作用。本实验通过检测FoxP3蛋白在老年乳腺浸润性导管癌及淋巴结转移灶中的表达来探讨其意义。

1 材料与方法

1.1标本 选取复旦大学附属金山医院病理科2009年1月至2011年12月外科手术切除的老年乳腺癌标本存档蜡块75例，所有病例均经病理切片证实为乳腺浸润性导管癌非特殊类型，诊断标准严格按照WHO2003乳腺癌的分类且腋下淋巴结检出数≥15枚〔3〕，所有病例均为女性，其中老年组(年龄>60岁)28例，平均年龄〔68.92±7.02(60～85)〕岁，11例伴腋下淋巴结转移；老年前期组(>45岁，≤60岁)32例，平均年龄〔53.15±3.84(45～58)〕岁，9例伴腋下淋巴结转移；青年期组(≤45岁)15例，平均年龄〔39.69±4.10(29～44)〕岁，5例伴腋下淋巴结转移。

1.2试剂 鼠抗人FoxP3单克隆抗体(Santa Cruz公司，1∶50稀释)，HRP标记二抗、(DAB)显色液、柠檬酸缓冲修复液(pH6.0)(均购自福州迈新生物技术公司)。

1.3方法 采用免疫组化EnVision两步法，按照试剂盒规定步骤进行操作：常规石蜡切片脱蜡至水，3%过氧化氢3 min，柠檬酸缓冲液热修复30 min，滴加一抗后4℃过夜，滴加二抗30 min，(DAB)显色，所有步骤间均PBS冲洗，苏木素衬染，中性树胶封片。以PBS代替一抗作为阴性对照，以试剂盒的阳性图片为阳性对照。

1.4结果判断 FoxP3定位于Treg细胞的细胞核和癌细胞的细胞质或细胞核，以出现棕黄色颗粒为阳性。采用免疫组化分数进行半定量分析〔4〕。每张切片观察10个高倍视野，分别给予阳性评分。 癌细胞：按染色强度分为0分(无染色)、1分(淡黄色)、2分(棕黄色)和3分(棕褐色)；按染色比例分为0分(<5%)、1分(5%～25%)、2分(26%～50%)、3分(51%～75%)、4分(>75%)。两者分数相加计算总分，≤6为低表达，>6为高表达。 FoxP3+淋巴细胞(Treg)评分：0分，无阳性细胞；1分，≤3个视野，每视野1～3个阳性细胞；2分，>3个视野，每视野1～3个阳性细胞；3分，>3个视野，每视野>3个阳性细胞。0分和1分为低表达，2分和3分为高表达。

1.5统计学方法 采用Stata8.0统计学软件进行统计分析，数据采取χ2检验及Fisher精确概率法，相关性采用Spearman相关分析。

2 结 果

2.1不同年龄组乳腺浸润性导管癌癌组织中FoxP3的表达 三个年龄组相比较，癌组织FoxP3和癌周FoxP3+淋巴细胞总体表达有差异(P<0.05)，与青年组相比，老年组显示癌组织FoxP3表达升高，同时癌周FoxP3+淋巴细胞数也高表达(P<0.05)，但相较老年前期病例组，老年组癌组织FoxP3及癌周FoxP3+淋巴细胞均与其未显示统计学差异(P>0.05)。见表1。

2.2不同年龄组乳腺浸润性导管癌原发灶及淋巴结转移灶中FoxP3蛋白的差异表达 三个年龄组中，淋巴结转移灶癌细胞FoxP3表达及FoxP3+淋巴细胞数量高于相应原发灶，但老年前期及青年期组未显示统计学差异，而老年组差异有统计学意义(P<0.05)。见表2，图1。

图1 不同年龄组乳腺癌淋巴结转移灶中FoxP3表达(EnVision法，×400)

2.3FoxP3表达与老年乳腺浸润性导管癌临床病理特征的关系 癌组织FoxP3的表达与淋巴结转移、Her2表达呈统计学正相关(P<0.05)，与ER呈负相关(P<0.05)，与组织学分级、肿瘤大小和PR未显示统计学相关(P>0.05)；癌周浸润的FoxP3+淋巴细胞与淋巴结转移、Her2呈统计学正相关，与ER、PR表达呈负相关(P<0.05)，与组织学分级、肿瘤大小未发现统计学相关(P>0.05)。见表3。

表1 乳腺浸润性导管癌癌组织中FoxP3的表达(n)

表2 乳腺浸润性导管癌淋巴结转移灶及对应原发灶中FoxP3蛋白的表达(n)

表3 FoxP3表达与老年乳腺浸润性导管癌临床病理特征的关系(n)

3 讨 论

FoxP3与Treg的分化决定和功能密切相关，最初对其研究集中在自身免疫性疾病方面，随着研究深入，大量事实表明Treg在肿瘤免疫抑制方面发挥了重要作用。在多种恶性肿瘤中均发现Treg的存在，乳腺癌中Treg与其预后相关性也得到证实〔5〕。目前认为Treg主要分为3个亚群：CD4+Treg细胞、CD8+Treg细胞和γδ-TCR，而CD4+Treg又进一步分为自然发生的CD4+CD25+FoxP3+ Treg、抗原诱导的CD4+CD25+FoxP3+ Treg和CD4+FoxP3-Trl细胞〔6〕。乳腺癌中FoxP3+Treg增多被认为是机体对乳腺癌恶性转化的反应，并且被作为肿瘤进展的指标〔7〕。多种因子能够直接或间接与Treg反应而发挥功能作用，TGF通路是Treg较为重要的作用机制之一，在肿瘤进展尤其是转移过程中极大地影响了肿瘤细胞的扩散能力。首先Treg表达细胞因子受体CCR4，受其配体CCL5、CCL17、CCL22等因子吸引聚集到肿瘤部位，激活后分泌大量TGF-β，后者通过各种途径加速肿瘤进展，比如介导血管内皮生长因子(VEGF)高表达从而促进肿瘤血管生成〔8〕,Treg还与某些癌基因存在相互作用,如K-ras等，但具体机制尚不明确。

目前研究发现FoxP3还是X染色体连锁的抑制基因，表达于多种恶性肿瘤细胞，包括乳腺癌、肺癌、肠癌、黑色素瘤等〔9〕，在乳腺癌细胞上表达的FoxP3与预后相关，尤其是乳腺癌淋巴转移者〔10〕。作为一种转录因子，FoxP3具有多种作用影响癌细胞的生长，近期研究认为FoxP3对乳腺癌癌基因SKP2和Her2存在转录抑制作用〔11，12〕。尽管FoxP3通常与乳腺癌不良预后相关，但最近有研究发现在Her2过表达的乳腺癌亚型中，FoxP3阳性表达与预后较好相关，具有独立的预后意义，其机制可能是通过抑制乳腺癌Her2的转录表达从而一定程度上对抗癌基因Her2的相关作用，抑制癌细胞生长，对乳腺癌发挥调节作用〔3〕，提示肿瘤本身的特性是FoxP3发挥作用的基础。与吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的协同作用也是可能的促进淋巴结转移的机制〔13〕。

FoxP3促进乳腺癌淋巴转移的机制目前尚未明确，可能从两方面起作用：一方面FoxP3+淋巴细胞(Treg)具有免疫抑制的作用，可通过细胞与细胞间直接接触或通过分泌某些炎症调节因子来间接调节，升高的Treg对机体的抗瘤免疫产生抑制，促进了癌组织的免疫逃避从而较容易发生转移。另一方面，乳腺癌组织表达的FoxP3可连接癌细胞表达化学因子受体CCR7和CXCR4，上调其转录、表达〔10〕，促进乳腺癌的浸润和转移。

国内目前尚未针对乳腺癌原发灶与淋巴结转移灶进行对比研究，本实验发现癌组织FoxP3蛋白表达及癌周FoxP3+淋巴细胞在老年患者中均有所升高，一个可能的原因是随着年龄增加，免疫系统的功能逐渐减弱，导致乳腺癌患者肿瘤免疫效能偏低下。一些国外研究显示FoxP3+淋巴细胞与ER、PR负相关，与组织分级、淋巴结转移、Her2正相关〔14，15〕，FoxP3的mRNA也检测到在PR阴性或Her2阳性的乳癌中高表达〔16〕，但是否FoxP3的表达具有一定的区域人群间差异尚不明确，有待进一步的研究。相对原发灶而言，淋巴结转移灶内FoxP3+淋巴细胞(Treg)增多，预示组织局部免疫状态的改变，同时转移灶中癌组织本身FoxP3蛋白也表达升高，提示FoxP3可能与乳腺浸润性导管癌淋巴结转移相关联，可以作为老年女性发生淋巴转移的乳腺浸润性导管癌的治疗靶点之一，反之，在作靶向治疗时也要考虑到原发灶与转移灶之间的差异性，制定合理的化疗、放疗方案。尽管FoxP3和FoxP3+淋巴细胞作为重要的因素影响乳腺癌的发生发展和浸润转移，但是并非单独发挥作用，许多复杂的机制参与乳腺癌的发生发展过程中，将FoxP3作为影响老年乳腺癌淋巴结转移的唯一指标而进行处置是不可取的。

4 参考文献

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16Ohara M，Yamaguchi Y，Matsuura K,etal.Possible involvement of regulatory T cells in tumor onset and progression in primary breast cancer〔J〕.Cancer Immunol Immunother，2009；58(3):441-7.