血管内皮细胞生长因子及生长抑制因子4在大肠癌中的表达

马广友 李俊杰 邵珠福

(辽宁医学院附属第一医院普外科，辽宁 锦州 121001)

研究表明，Dukes A、B期大肠癌患者术后5年生存率可达73.3%～82.6%〔1〕，及早发现、及早治疗可以争取到更好的治疗效果，提高患者的预后。然而，目前大肠癌的早期发现、早期诊断及早期治疗均不理想，误诊率可高达60%～70%，目前临床上确诊的Dukes A期大肠癌患者仅占10%左右〔2，3〕，多数患者确诊时已经为晚期，失去了治疗的最佳时机。因此，大肠癌的早期诊断和早期治疗是重要的防治研究方向。肿瘤的生长及转移依赖于肿瘤血管生成，抑制肿瘤的血管生成可以显著抑制肿瘤的生长。血管内皮细胞生长因子(VEGF)与肿瘤的发生、发展及转移密切相关，在评估患者的治疗效果和预后中有重要作用。生长抑制因子(ING)家族是一类肿瘤抑制基因，能够抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡〔4〕，其在抗肿瘤中的作用及机制越来越受到重视。因此，本研究通过检测VEGF和ING-4在大肠癌组织中的表达，探讨二者在大肠癌发生及发展过程中的作用。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择辽宁医学院附属第一医院2008年5月至2010年3月收治的经手术病理证实的68例大肠癌患者，均有完整的临床资料及随访资料。68例患者中，男性41例，女性27例；年龄37～79岁，平均(58.3±2.9)岁；结肠癌30例，直肠癌38例；高分化腺癌17例，中分化腺癌38例，低分化腺癌5例，黏液腺癌8例；Dukes分期：B期15例，C期31例，D期22例。选择同期20例经病理证实的大肠腺瘤及20例经病理检查为正常的肠黏膜组织作为对照。

1.2免疫组化检查 所有组织标本经10%中性甲醛溶液固定，常规石蜡包埋后行4 μm连续切片，采用S-P二步法检测各组织VEGF及ING-4蛋白的表达。采用兔抗人VEGF及ING-4蛋白多克隆抗体(Santa Cruz公司)，工作浓度为1∶50，DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司，所有操作均严格按照试剂盒说明书进行。以PBS代替一抗作为阴性对照、已知阳性切片作为阳性对照。

1.3结果判断 所有病理切片由2名病理科医师在未知受检者情况的前提下阅片，每张切片取5个400倍视野观察，每个视野计数100个细胞，记录阳性细胞数。ING-4蛋白以细胞核呈棕褐色为阳性细胞，VEGF蛋白以细胞质或细胞膜内呈棕褐色为阳性细胞。采用半定量法确定染色强度，无着色、浅黄色、棕黄色、棕褐色分别记为0、1、2、3分；阳性细胞≤5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、≥76%分别记为0、1、2、3、4分。总分=阳性细胞染色强度评分+阳性细胞评分，0～1分(-)，2～3分(+)，4～5分()，6分以上()；≤3分为弱表达，≥4分为强表达〔5〕。

1.4统计学方法 采用SPSS12.0统计学软件进行分析，比较采用χ2检验，采用Kaplan-Meier法分析患者的生存情况，采用Gehan比分检验比较患者的生存率。

2 结 果

2.1VEGF及ING-4蛋白在不同大肠组织中的表达 由表1可见，VEGF蛋白在大肠癌组、大肠腺瘤组及正常组中的阳性表达率依次下降，大肠癌组VEGF蛋白阳性率显著高于大肠腺瘤组和正常组(χ2=11.24、18.91，P<0.05、P<0.01)；大肠腺瘤组VEGF蛋白阳性率也高于正常组(χ2=7.33，P<0.01)。ING-4蛋白在大肠癌组、大肠腺瘤组及正常组中的阳性表达率依次升高，大肠癌组ING-4蛋白阳性率显著低于大肠腺瘤组和正常组(χ2=4.60、8.71，P<0.05)；大肠腺瘤组ING-4蛋白阳性率也低于正常组(χ2=3.62，P<0.05)。

表1 VEGF及ING-4蛋白在不同大肠组织中的阳性表达差异〔n(%)〕

2.2大肠癌患者VEGF及ING-4蛋白阳性表达与临床病理特征的关系 VEGF蛋白在浸润浆膜外层的大肠癌组阳性率显著高于浸润肌层及浆膜层者(χ2=6.73，P<0.05)，在Dukes C、D期大肠癌患者中的阳性率高于A、B期者(χ2=11.82，P<0.05)，在发生淋巴结转移的大肠癌组阳性率高于无淋巴结转移者(χ2=5.00，P<0.05)，提示VEGF蛋白阳性表达可能与大肠癌的浸润深度、临床分期和淋巴结转移有关。ING-4蛋白在高、中分化大肠癌组阳性率显著高于低分化组(χ2=4.61，P<0.05)，在Dukes A、B期大肠癌患者中的阳性率高于C、D期(χ2=12.03，P<0.05)，在发生淋巴结转移的大肠癌组阳性率高于无淋巴结转移者(χ2=17.00，P<0.05)，提示ING-4蛋白阳性表达可能与大肠癌的分化程度、临床分期和淋巴结转移有关。见表2。

表2 大肠癌患者VEGF及ING-4蛋白阳性表达与临床病理特征的关系〔n(%)〕

2.3VEGF及ING-4蛋白表达与大肠癌患者生存期的关系 Kaplan-Meier分析结果显示，VEGF阳性大肠癌患者3年生存率及5年生存率均显著低于阴性患者(U=23.57，P<0.05)；ING-4阳性大肠癌患者3年生存率及5年生存率均略高于阴性患者，但差异无统计学意义(U=0.06，P>0.05)。见表3。

表3 VEGF及ING-4蛋白表达与大肠癌患者生存期的关系(%)

3 讨 论

研究表明，肿瘤的持续生长依赖新生血管的形成〔6，7〕，肿瘤新生血管能够为肿瘤的生长提供充足的营养，而且也是肿瘤细胞发生浸润和转移的直接途径。肿瘤细胞所分泌的多种血管生长因子能够诱发内皮细胞发生增殖和迁移，其中VEGF是最重要的促血管生长因子之一。

本研究结果提示大肠癌组织中VEGF蛋白表达被上调。VEGF蛋白在浸润浆膜外层的大肠癌组阳性率显著高于浸润肌层及浆膜层者，在Dukes C、D期大肠癌患者中的阳性率高于A、B期者，与Kumar等〔8〕的研究结果一致，而VEGF在发生淋巴结转移的大肠癌组阳性率高于无淋巴结转移者，提示VEGF蛋白阳性表达可能与大肠癌的浸润深度、临床分期和淋巴结转移有关。其可能的机制为：VEGF通过与内皮细胞上的特异性受体结合，刺激血管内皮细胞增殖和毛细血管袢形成，进而产生血浆纤维酶原激活剂和胶原酶〔9〕，从而促进血管生成，并促使癌细胞脱落进入血管，或者向邻近组织扩散，促进肿瘤发生浸润和淋巴转移。

ING-4是由Shiseki等〔10〕于2003年首次分离得到的生长抑制因子家族的新成员，是一种抑制肿瘤发生的重要因子，可以抑制低氧诱导因子-1的活性，同时促进细胞凋亡、阻滞细胞周期，从而抑制肿瘤的增殖〔11〕。ING-4在脑胶质瘤、肺癌等恶性肿瘤中均呈低表达〔12，13〕。

本研究中，大肠癌组织中ING-4蛋白表达显著低于大肠腺瘤组织和正常肠黏膜组织，提示大肠癌组织中ING-4蛋白的表达被下调。大肠癌组织中ING-4蛋白的缺失使体内的脯氨酸羟化酶-2不能抑制低氧诱导因子-1的活性，弱化了细胞凋亡作用，同时肿瘤细胞周期失去调控，从而导致肿瘤细胞无限增殖。ING-4蛋白在高、中分化大肠癌组阳性率显著高于低分化组，在Dukes A、B期大肠癌患者中的阳性率高于C、D期，在发生淋巴结转移的大肠癌组阳性率高于无淋巴结转移者，提示ING-4蛋白阳性表达可能与大肠癌的分化程度、临床分期和淋巴结转移有关。本组ING-4蛋白以中分化大肠癌组阳性率最高，可能与本组纳入研究对象中分化患者所占比例最多有关，但ING-4蛋白在高、中分化大肠癌组阳性率显著高于低分化组，提示ING-4蛋白阳性表达与大肠癌的分化程度有关。目前ING-4蛋白表达缺失与肿瘤发生淋巴结转移的作用机制尚未完全阐明，还需进一步深入研究。

Kaplan-Meier分析显示，VEGF阳性大肠癌患者3年生存率及5年生存率均显著低于阴性患者，而ING-4阳性大肠癌患者3年生存率及5年生存率较阴性患者并无显著差异，提示VEGF可能是提示大肠癌患者预后的一个重要指标〔14〕，而ING-4不是影响大肠癌患者预后的独立危险因素。

4 参考文献

1蔡善荣，郑 树，张苏展.不同年龄组大肠癌预后多因素分析的比较〔J〕.中华肿瘤杂志，2005；27(8)：483-5.

2李 芳.50岁以上无症状大肠癌的筛查与早期防治〔D〕.河北医科大学硕士学位论文，2012.

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4Nagashima M，Shiseki M，Pedeux RM,etal.A novel PHD finger motif protein，p47ING3，modulates p53-mediated transcription，cell cycle control，and apoptosis〔J〕.Oncogene，2003；22(3)：343-50.

5何春年，徐翠清，赵焕芬，等.在子宫颈上皮内瘤变和鳞癌组织中CyclinE、Rb基因表达的研究〔J〕.中国组织化学与细胞化学杂志，2007；16(3)：330-5.

6Hsu AW，Sodhi A，Eberhart C,etal.Regression of choroidal neovascularization in response to systemic chemotherapy for cancer〔J〕.Canadian J Ophthalmol，2013；48(4)：e80-2.

7Nunez-Cruz S，Gimotty PA，Guerra MW,etal.Genetic and pharmacologic inhibition of complement impairs endothelial cell function and ablates ovarian cancer neovascularization〔J〕.Neoplasia，2012；14(11)：994-1004.

8Kumar H，Heer K，Lee PW,etal.Preoperative serum vascular endothelial growth factor can predict stage in colorectal cancer〔J〕.Clin Cancer Res，1998；4(5)：1279-85.

9朱慰祺.血管内皮生长因子与大肠癌浸润、转移、预后的关系〔J〕.中国实用外科杂志，2000；20(2)：124-5.

10Shiseki M，Nagashima M，Pedeux RM,etal.p29 ING4 and p28 ING5 bind to p53 and p300，and enhance p53 activity〔J〕.Cancer Res，2003；63(10)：2373-8.

11赵大航，王保新，王文波.生长抑制因子-4抗肿瘤作用〔J〕.国际肿瘤学杂志，2012；39(6)：422-4.

12Klironomos G，Bravou V，Papachristou DJ,etal.Loss of ING4 is implicated in the pathogenesis and progression of human astrocytomas〔J〕.Brain Pathol，2010；20(2)：490-7.

13Wang QS，Li M，Zhang LY,etal.Down-regulation of ING4 is associated with initiation and progression of lung cancer〔J〕.Histopathology，2010；57(2)：271-81.

14武鸿斌，宋 燕，谢忠士，等.PTEN与VEGF在大肠癌组织中的表达及其临床意义〔J〕.中国老年学杂志，2008；28(5)：473-4.