肝细胞生长因子在糖尿病大鼠肝脏的表达

王静波

(解放军第309医院眼科，北京 100091)

肝细胞生长因子(HGF)是目前已知的生物活性最广泛的生长因子之一。HGF通过与特异性膜受体c-met结合而发挥其多样生物学作用。除了促进有丝分裂活性外，HGF还作为离散因子促进细胞扩散和迁移。研究证实，HGF/c-met在组织器官损伤后的再生中发挥重要作用。本研究观察糖尿病大鼠肝脏中HGF的表达变化。

1 材料与方法

1.1试剂 链脲佐菌素(STZ，Sigma公司，美国)，兔抗鼠HGF多克隆抗体(Santa Cruz公司，美国)，枸橼酸盐粉剂、磷酸盐缓冲液(PBS)粉剂、二步法免疫组化检测试剂盒、DAB试剂盒、苏木素(北京中杉金桥生物技术有限公司，北京)，安稳血糖仪及血糖测试条(长沙三诺有限公司)，冷冻包埋剂(樱花，美国)。

1.2实验动物及模型制备 雄性SD大鼠24只，SPF级，体质量(120±20 g)，由军事医学科学院动物中心提供。大鼠在SPF级动物中心饲养，室内温度25℃左右，湿度约50%。明暗周期12 h，自由饮水和进食。适应性喂养1 w后，进行动物造模。

造模前，禁食12 h(不禁水)。STZ 65 mg/kg腹腔注射，对照组腹腔注射枸橼酸盐溶液。72 h后测血糖，随机血糖≥16.7 mmol/L即为造模成功。每周监测血糖。

1.3标本制备 造模成功后第3、6、9、12和15周，分别采用过量氯胺酮麻醉致死，迅速摘除肝脏。切取块状肝脏大叶组织，冷冻包埋剂包埋，连续切出5 μm厚度切片，贴于免疫组化专用防脱载玻片上，晾干后甲醇固定，-80℃冰箱保存。

1.4免疫组化染色及结果判读 冰冻切片用PBS冲洗，3%过氧化氢溶液室温10 min，PBS洗，稀释的HGF抗体(1∶200)室温孵育2 h，通用型IgG抗体-辣根过氧化物酶多聚体37℃ 20 min，PBS洗，DAB显色，PBS洗，苏木素复染，自然水冲洗，梯度酒精及二甲苯脱水，中性树胶封片，照相。所有切片由同一位经验丰富的病理科医师盲法阅片做出判定，每张切片观察5个×400视野。以组织切片背景清晰、细胞浆染为淡黄至棕黄色为阳性细胞标志。结果判定标准如下：不着色者为阴性，淡黄色及着色细胞<1/3为弱阳性，黄色及着色细胞占1/3～1/2为中度阳性，棕褐色着色阳性细胞>1/2为强阳性。

2 结 果

2.1糖尿病大鼠一般情况观察 对照组大鼠体重增加明显，精神状况良好，毛皮有光泽，动作自如，反应灵敏。糖尿病大鼠出现了典型的“三多一少”症状，多饮、多食、多尿，明显消瘦，精神逐渐萎靡，早期多动，后期反应迟钝，动作缓慢，毛竖而无光泽。12 w时，部分大鼠出现白内障。

2.2肝脏一般结构观察 对照组大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞索排列整齐。糖尿病组大鼠肝小叶结构紊乱，肝细胞的胞质内可见大量小空泡。糖尿病12 w时，肝细胞开始水肿；糖尿病15 w时，肝细胞水肿尤明显。

2.3肝细胞HGF的表达 对照组大鼠肝细胞HGF呈弱阳性表达。糖尿病3 w时，肝细胞HGF表达即开始增强。糖尿病6 w时，肝细胞HGF呈中度阳性表达。糖尿病12 w时，肝细胞HGF呈强阳性表达。糖尿病15 w时，肝细胞HGF的表达较12 w时减弱，但较对照组仍明显增强。见图1。

图1 大鼠肝脏肝细胞生长因子的表达 (免疫组化，×200)

3 讨 论

在美国，肝脏病变是2型糖尿病患者死亡的主要原因之一。2型糖尿病患者肝脏病变的标准死亡率远远高于心血管并发症的标准死亡率。糖尿病肝脏病变包括非酒精性脂肪肝病、肝硬化、肝细胞性肝癌、慢性肝炎、急性肝功能衰竭，其中最常见的是非酒精性脂肪肝病。非酒精性脂肪肝病在2型糖尿病患者中发病率达50%，在糖尿病伴肥胖患者中发病率近100%〔1，2〕。

HGF是一种分泌型肝素亲和糖蛋白，由间质细胞产生，与受体c-met结合并激活该受体的酪氨酸酶活性，促进肝细胞、上皮细胞、内皮细胞、造血细胞等多种细胞的生长、迁移、形态变化〔3〕。HGF对肝细胞有直接保护作用，可改善肝纤维化、降低死亡率〔4〕。在高表达HGF的转基因小鼠，半乳糖胺对肝细胞的损伤几乎被完全抑制。在肝脏部分切除后，肝细胞HGF的表达增强，促进了肝细胞的增殖，促进损伤的修复〔5〕。因而，HGF是肝细胞的保护剂。除了保护肝细胞外，HGF可保护机体的很多细胞，如肾小球细胞、肾小管细胞、血管内皮细胞、胰岛细胞〔6，7〕。高糖刺激的血管内皮细胞、肾小管上皮细胞及肾小球细胞，HGF的表达均表现为先增高后减低的趋势〔6〕。与对照组相比，胰岛过度表达HGF的转基因小鼠，胰岛体积增大，胰岛数量增多，β细胞复制率提高〔7，8〕。HGF干预能使糖尿病大鼠β细胞凋亡指数显著降低〔8〕。

在糖尿病早期，高糖损伤引起机体防御反应，肝细胞HGF表达增加，促进细胞有丝分裂，对损伤的细胞进行修复；随着高糖刺激时间的延长，机体防御反应的能力逐渐下降，高糖诱导了细胞的凋亡，HGF表达下调。Araújo等〔9〕的研究表明，HGF/c-met可能在肝脏胰岛素信号转导中起重要作用。

在本研究中，笔者观察到糖尿病肝脏中HGF蛋白呈先增高后减低的趋势改变。但HGF的这种变化对肝细胞的作用及其作用机制尚需更进一步的研究。

4 参考文献

1Tolman KG，Fonseca V，Tan MH,etal.Narrative review：hepatobiliary disease in type 2 diabetes mellitus〔J〕.Ann Intern Med，2004；141:946-56.

2王蓉蓉，谢 琳，吴晓烨，等.银杏叶提取物对实验性2型糖尿病大鼠肝脏的保护作用〔J〕.中国病理生理杂志，2007；23(4):566-9.

3Nakamura T，Matsumoto K，Mizuno S,etal.Hepatocyte growth factor prevents tissue fibrosis，remodeling，and dysfunction in cardiomyopathic hamster hearts〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005；288:2131-9.

4任春峰，陈会松，王青霞.促肝细胞生长因子对ConA致小鼠肝损伤保护机制探讨〔J〕.中国实验诊断学，2008；12(12):1483-5.

5朱 洪，肖曙峰，田大广，等.HGF和SAM对慢性肝损伤大鼠肝部分切除术后肝细胞的影响〔J〕.中国普通外科杂志，2009；18(1):40-3.

6刘青娟，何 宁，刘淑霞，等.糖尿病肾病大鼠肾小管上皮细胞转化与肝细胞生长因子的表达〔J〕.中国慢性病预防与控制，2005；13(6):266-8.

7陈洪流，蒙碧辉，黄 松，等.罗格列酮对糖尿病大鼠残存胰岛表达肝细胞生长因子的影响〔J〕.中国糖尿病杂志，2010；18(1):63-6.

8Dai C，Huh CG，Thorgeirsson SS,etal.Beta-cell-specific ablation of the hepatocyte growth factor receptor results in reduced islet size，impaired insulin secretion，and glucose intolerance〔J〕.Am J Pathol，2005；167:429-36.

9Araújo TG，Oliveira AG，Carvalho BM,etal.Hepatocyte growth factor plays a key role in insulin resistance-associated compensatory mechanisms〔J〕.Endocrinology，2012；153:5760-9.