胃癌淋巴结的微转移和胃癌生物学行为的关系

邹勤光 所 剑 王大广 何 亮

(吉林省肿瘤医院胸外二科，吉林 长春 130012)

恶性肿瘤的转移和复发是影响肿瘤病人预后的重要因素，胃癌的转移方式主要是通过淋巴途径，即使是早期胃癌，其淋巴转移率也可达8%～15%〔1〕，而胃癌淋巴结的微转移可能是导致淋巴结转移主要原因。微转移目前尚无统一的概念，一般是指非血液系统的恶性肿瘤在发展过程中，播散并存活于淋巴系统、血液系统、骨髓、肝、肺等组织器官中的微小肿瘤细胞灶，常无任何临床表现〔2〕，普通病理检查及常规诊断学检查手段很难发现〔3〕。胃癌的生物学行为是指反映和表现胃癌性质或者恶性程度的指标。因此明确胃癌淋巴结微转移和胃癌生物学行为之间的关系对胃癌病人的临床治疗有重要的指导意义。

1 材料与方法

1.1研究对象 研究组(胃癌淋巴结临床转移阴性组)选择吉林大学第一医院普通外科自2006年3～10月期间经病理诊断确定为胃癌，并行D3手术的患者共83例。取其胃周围淋巴结共245枚，且这些淋巴结经常规病理检查证实无临床转移。阴性对照组选取因胃溃疡，胃间质瘤等其他胃部疾病而行胃大部切除术的病人8例，淋巴结共76枚。阳性对照组选取行D3手术的胃癌患者共31例，淋巴结141枚，并且这些淋巴结经普通病理检验证实有临床转移。

1.2标本选取 所有淋巴结均经过标记后，一半送病理科行常规检查，另一半立即保存于-70℃低温冰箱里保存待用。

1.3引物合成 选择CK18引物及内参照基因引物(引物由大连宝生物公司提供),CK上游引物序列：5′ AAGAAAACCCGAAGAGG3′，下游引物：5′ TCTGACTCAAGGTGCAGC3′，扩增片段121 bp；β-actin引物序列：上游引物：5′ GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3′，下游引物：5′ CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3′，扩增片段500 bp。

1.4Trizol Reagent提取淋巴结总RNA(total RNA，tRNA) 按照Trizol Reagent说明提取淋巴结的总RNA，-70℃保存。提取方法如下：取淋巴结组织约100 mg，置于研磨器中，加入1 ml Trizol Reagent，匀浆。裂解液放入1ml DEPC水泡过并高压后的Ep管中。室温孵育5 min，使核蛋白复合物充分裂解。每管加200 μl氯仿，盖上管盖，剧烈翻转15 s，室温静置3 min。4℃离心15 min。将上层水相转移到一新的1 ml DEPC水泡过并高压后的EP管中，加入500 μl异丙醇，室温静置10 min。4℃离心10 min。离心后，在试管底部可见白色胶状沉淀。弃上清，在离心管中加入1 ml 75%的乙醇洗涤RNA沉淀。用混悬器混合离心管，4℃离心5 min。弃上清，空气中干燥RNA，然后加入50 μl高压后的DEPC水。取10 μl用紫外分光光度计测OD值，再取4.5 μl进行甲醛变性的琼脂糖凝胶电泳。

2.2CK18 mRNA表达与患者临床病理特征的关系 研究组微转移阳性患者同无淋巴结微转移的胃癌患者相比，其肿瘤组织分化明显更差；肿瘤侵犯的深度更深；同时浸润性生长所占的比率大；Borrmann分型中Ⅲ、Ⅳ型肿瘤所占的比率更大(P<0.05)。而对二者进行肿瘤的部位，年龄、性别等因素进行比较，结果无明显差异(P>0.05)。见表1。

①饮食清淡,忌辛辣次惊性食物,多食新鲜蔬菜。水果。②注意点眼卫生:点眼钱用肥皂洗净双手,仰卧位,辦开下眼睑,药品口距结膜囊1-2CM,向结膜囊内滴入1-2滴眼液,连续点两种或以上眼药时,需要间隔3-5分钟,禁止将眼药点健眼,或者让家人使用,尤其含激素的眼药不能随意点,按医生要求执行和停用。每日正常洗脸,注意用眼卫生,单独使用一张毛巾,每周用开水煮沸消毒一次,勿揉眼睛,勿让脏物或脏水进入眼内。③活动与休息:避免过度用眼,禁止剧烈运动,如:跳、跑、抬、举④部分患者涉及戴镜或弱视训练,请复查时严格遵医师指使执行。⑤按照医师指定的时间内复查。

1.7统计学方法 采用统计软件SPSS14.0处理。结果百分率用χ2检验。

全诗描写了温馨的场景：华堂绮窗，佳人对月弦歌，友人酬唱，贵族宴乐，诗人被歌声和美酒所陶醉，意气相投，一掷千金而不惜，尾句正是全诗寓意所在。

2 结 果

微转移的检测方法有多种。连续切片是最早用于检测淋巴结微转移的一种粗略方法。近年来已很少使用。细胞培养方法敏感性更高些。欠缺的是条件要求严格，影响环节多。免疫组化、免疫荧光和放射免疫检测具有重要应用价值，但单抗的质量、交叉反应、机体产生自身抗体等因素影响其敏感性、特异性〔8〕。转基因法〔9〕技术条件要求高，只能用于实验研究阶段，尚不适用于临床研究。多参数的流式细胞仪已成功应用于微转移肿瘤细胞的识别，但因其方法复杂、价格昂贵，临床上很难推广〔10〕。

1.6数据处理分析 应用Glyko bandscan分析系统分别测定样本每个淋巴结CK18 mRNA及β-actin阳性条带的总灰度，测量2次取平均值。并计算每个淋巴结CK18 mRNA/β-actin的值。以CK18 mRNA/β-actin的值≥1.5为CK18 mRNA高度表达，以CK18 mRNA/β-actin的值<1.5为低度表达或者不表达，分别检验研究组、胃癌淋巴结临床转移阳性组及其他胃部疾病组患者淋巴结CK18 mRNA表达情况。再对研究组患者中反映肿瘤生物学行为的因素如肿瘤大体分型、组织学类型、肿瘤侵犯深度、肿瘤部位等的情况同其淋巴结微转移的情况相联系进行比较。

基因检测具有高度敏感性、特异性，可准确检测1 mg组织或1 ml液体中的1个癌细胞，被认为是目前检测微转移的最有效方法。可检测的标志物种类众多，如可以检测异常基因p53〔11〕、ras、ApC、DCC、CD44〔12〕、erb-B2等。

1.5甲醛变性的琼脂糖凝胶RNA电泳 用35 ml蒸馏水融化0.7 g琼脂糖，冷却至60℃左右加入10 ml甲醛和11 ml 5×缓冲液(0.1 mmol/L MOPS PH7.0，40 mmol/L乙酸钠，50 mmol/L EDTA)混匀，灌制凝胶，将凝胶浸于1×甲醛电泳缓冲液中准备电泳，每孔上样20 μl(4.5 μl RNA，2.0 μl 5×缓冲液，3.5 μl甲醛，1.0 μl甲酰胺)，上样前样品于65℃加热15 min，冰水中冷却，离心后加2.0 μl 10×上样缓冲液(50%甘油，1.0 mmol/L EDTA，0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF)，混匀后上样，在100 V电压下电泳0.5 h，用溴化乙锭染色30 min，紫外分析仪下拍照记录。紫外分光光度计测定tRNA浓度：取10 μl tRNA溶液，加入990 μl高压后的DEPC处理水，在260 nm紫外波长下测定tRNA的OD值，计算tRNA含量。RT-PCR扩增：逆转录体系为取25 μl样本RNA，加oligo dT 3 μl，DEPC水2 μl，70℃孵育5 min，冰浴5 min，加5×Buffer 10 μl，dNTP 4 μl，RNAsin 1 μl，AMV 1 μl，DEPC水4 μl。扩增采用Gene Amp PCR System 2400型PCR扩增仪进行PCR扩增，按如下条件进行循环：94℃预变性5 min，95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共35个循环，终末72℃延伸10 min。产物用1%琼脂糖电泳，紫外透射仪下观察并照相记录结果。

*本文为2013年度中央文献对外翻译与传播协同创新中心项目“中央军事文献对外传播流程研究”（编号：2013XT10）的阶段性成果。

图1 研究组患者CK18 mRNA电泳图

表1研究组微转移阴、阳性患者CK18mRNA阳性表达与患者临床病理特征的关系〔n(%)〕

临床病理特征研究组微转移阳性(n=51)微转移阴性(n=32)P值浸润生长39(76.5)8(25.0) <0.05分化差者43(84.3)13(40.6) <0.05浆肌层及浆肌层以外受侵犯44(86.2)11(34.4) <0.05BorrmannⅢ及Ⅳ型患者比例47(92.1)12(37.5) <0.05肿瘤部位胃上部4(7.8)4(12.5) >0.05胃体部7(13.7)6(18.7) >0.05胃窦部20(39.2)22(68.8) >0.05患者平均年龄(岁)6763 >0.05性别男22(43.1)21(65.6) >0.05女9(17.6)11(34.4) >0.05

3 讨 论

胃癌淋巴结的转移状况是影响预后的一个重要因素〔1〕，并且淋巴结转移、浆膜受侵是胃癌术后各种复发包括术后早期(术后24个月以内)复发的危险因素〔2〕。还有些学者〔3〕认为淋巴结临床转移阴性的胃癌其临床病理生物学特性与早期胃癌相似，手术后预后较好，而有淋巴结转移的胃癌预后则较差。对胃癌病人行系统性淋巴结清扫术能明显改善其预后情况，延长生命，并且不增加手术并发症，术后5年生存率可达50%以上〔4，5〕。良好的手术效果可能与早期诊断(可使临床病理分期提前)及广泛彻底的淋巴清扫有关。Bosing等〔5〕报道胃癌患者行根治性术后总体5年生存率达49%，且胃癌病人无淋巴结转移(pTx pN0)或转移局限于胃周淋巴结(pTx pN1)者行系统性淋巴结清扫术后生存率明显增加。但也有学者报道认为广泛淋巴清扫不能改善胃癌病人的预后，且增加手术并发症〔6〕。

微转移是肿瘤转移、复发的基础和前提，因此对于微转移灶的检测有利于判断患者临床分期及预后以及指导治疗〔7〕。也正是因为这个原因广大学者在积极开展对微转移的检测方法的研究。本实验就是应用近几年广泛开展的半定量RT-PCR技术以CK18为标记检测胃癌淋巴结的微转移情况，并把检测结果与胃癌的肿瘤生物学特点进行比较分析以明确二者联系。

2.1CK18 mRNA表达 研究组共有83例患者245枚淋巴结，其中51例(61.4%)患者的125枚(51.1%)淋巴结CK18 mRNA高度表达即这些淋巴结微转移阳性。阴性对照组患者8例淋巴结76枚CK18 mRNA全部无表达；阳性对照组患者31例，淋巴结141枚CK18 mRNA全部高表达。见图1。

党的十八大以来，在应对“把绿水青山转化为金山银山”的问题上，江西因势而定、乘势而上，坚持把发展绿色产业、促进产业绿色化，作为促进经济发展与资源环境相协调的基本途径。

目前以CK家族为标志物利用RT-PCR来检测胃癌淋巴结是极为常用和非常有效的方法，当然，现阶段RT-PCR检测肿瘤微转移尚存在一定局限性。包括缺乏肿瘤特异性靶RNA、靶RNA的非特异性表达、假阳性和假阴性问题的困扰。但是随着新的肿瘤特异性靶RNA的发现、PCR反应条件的优化以及定量PCR技术的不断成熟〔13〕，涉及肿瘤细胞的微转移灶的诊断将更为敏感、特异和可靠，相信RT-PCR方法将会成为检测临床肿瘤微转移的常规方法。

长期以来世界各地学者关于进展期胃癌的手术中淋巴结清扫范围意见不统一〔14，15〕。本研究结果认为胃癌淋巴结存在较高的微转移。而且普通病理难以发现的这些淋巴结微转移，同时我们发现胃癌淋巴结的微转移同癌灶浸润深度、肿瘤的大体类型、组织学分型等生物学行为特点密切相关。可以明确远站淋巴结微转移阳性的患者其肿瘤生物学行为明显更趋向恶性特点。另一方面仅有微转移的淋巴结大多数仅有轻微肿大，容易造成术中被外科医生忽视，导致清扫不彻底，而影响患者预后。因此我们认为，胃癌的根治性手术中应常规对胃癌各站淋巴结进行清扫以降低术后肿瘤复发的概率。另一方面我们也主张在术后应该对这些远站淋巴结进行微转移的检测并根据结果指导术后的治疗及判断肿瘤的临床分期。当然这个结论还有待于对这些患者的预后进行跟踪随访而进一步明确。

不过哥哥讲故事的时候，翠姨总比我们留心听些，那是因为她的年龄稍稍比我们大些，当然在理解力上，比我们更接近一些哥哥的了。哥哥对翠姨比对我们稍稍的客气一点。他和翠姨说话的时候，总是“是的”“是的”的，而和我们说话则“对啦”“对啦”。这显然因为翠姨是客人的关系，而且在名分上比他大。

胃癌的合理分期对于指导选择综合治疗方案，判断疗效及预后具有重要的意义。本实验结果表明研究组中所有患者按照传统的TNM分期均应该为N0 期，然而对照组中胃癌淋巴结微转移阳性的病人其各项肿瘤生物学行为特点与淋巴结微转移阴性的病人相比均又显著差异，胃癌淋巴结微转移阳性的病人其肿瘤生物学行为特点恶性程度更高。因此是淋巴结微转移情况对胃癌患者进行临床分期的划分和预后的判断的不可忽视的重要因素，应该成为TNM分期的一项重要参考指标。但是由于胃癌淋巴结的微转移由于检测起来相对要求更高的实验室技术及实验人员技术，并需要一定时间，而且现在没有为广大学者公认的检测胃癌淋巴结微转移的简单，可靠，而且有效的方法。因此对胃癌淋巴结的微转移的检测在临床上的应用价值还有待探讨，其具体意义有待进一步探索和阐述。

总之，通过本实验可以看出胃癌淋巴结的微转移与胃癌的各种生物学行为特点密切相关，其微转移的情况因该作为临床中指导胃癌的临床分期及治疗方法的一个重要参考条件，但是由于本实验时间有限制，缺乏对患者5年生存率的直观观察因此对于胃癌淋巴结尤其是远站淋巴结微转移阳性与患者预后情况还有待进一步的研究。

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