脓毒症大鼠脂联素的表达变化及与TNF-α的关系

陈建南 丁毅鹏

(海南省人民医院急诊科，海南 海口 570311)

脓毒症及其引起的多种器官功能障碍是感染、创伤、严重烧伤等危重患者死亡的主要原因之一〔1, 2〕。研究发现，一些创伤较严重的疾病并发脓毒症的概率在逐年递增，严重危害人类的生命。医疗界一直在寻找治疗脓毒血症的有效方法。脂联素(ADP)是一种具有内源活性的多肽，主要是由脂肪细胞分泌的。研究发现，很多慢性疾病如动脉粥样硬化、糖尿病等患者体内的ADP水平较低，而炎症因子的表达较高〔3,4〕。这两者的变化是否与脓毒症有关，目前研究较少。本研究采用大鼠脓毒血症的模型，观察大鼠的生存率以及组织中ADP以及炎症因子肿瘤坏死因子(TNF)-α的水平，初步探讨脓毒血症的发生发展与ADP以及TNF-α表达水平之间的关系。

1 材料与方法

1.1实验动物模型 取健康的雄性Wistar大鼠60只，体重200～300 g，随机分成正常对照组、脓毒血症组、生存率观察对照组、生存率观察脓毒血症组，每组15只。两组大鼠均采用七氟醚吸入麻醉后，尾静脉注射内毒素(LPS)或者生理盐水。在注射后4、24 h分别处死大鼠，检测血浆中ADP以及TNF-α的水平，组织中检测ADP以及TNF-α mRNA的水平变化。另两组生存率观察组大鼠采用相同的饲养条件以及相同的处理方法，观察其24 h的生存率。

1.2标本采集 大鼠采用七氟醚吸入麻醉后，抽取全血5 ml，1 200 r/min离心10 min，收集血浆，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，并且留取大鼠附睾脂肪组织，-80℃保存。

1.3RT-PCR检测组织中ADP以及TNF-α mRNA的水平 取脂肪组织80 mg，超声匀浆后按照说明书用Trizol法提取RNA，LPS的上游序列为5′-TCCTGGTCACAATGGGATACC-3′，下游序列为5′-ATCTCCTGGGTCACCCTTAGG-3′， TNF-α的上游序列为5′-GTAGCCCACGTCGTAGCAAA-3′， 下游序列为5′-TGGTGAAAGACGCCAGTAGACTC-3′。PCR反应条件为94℃ 5 min，94℃ 40 s、53℃ 45 s、72℃ 45 s，共32个循环，最后72℃ 10 min。

1.4ELISA法检测血浆中ADP以及TNF-α的水平 按照ELISA试剂盒说明书进行检测。

2 结 果

2.1两组大鼠生存率及一般情况比较 正常组大鼠表现正常，而脓毒血症组大鼠在造模后30 min开始出现竖毛、厌食、眼角分泌物增多等中毒症状，并且随着时间的推移出现腹泻、精神萎靡、血尿等休克症状，严重者死亡；在24 h内，正常对照组大鼠未发生死亡，脓毒血症组大鼠死亡9只，死亡率为60%，说明大鼠脓毒血症造模成功。见图1。

2.2两组大鼠血浆中ADP以及TNF-α的水平 脓毒血症组大鼠血浆中ADP在注射4 h后开始下降，并持续下降至24 h时。而TNF-α的水平在注射4 h后显著升高，在24 h时显著下降，但与正常对照组相比差异仍具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

图1 两组大鼠生存曲线

表1 两组大鼠血浆中ADP以及TNF-α的水平

2.3两组大鼠组织中ADP以及TNF-α mRNA的水平 用RT-PCR的方法检测两组大鼠组织ADP以及TNF-α mRNA的水平发现，脓毒血症大鼠在注射LPS 4 h后，ADP的表达较正常对照组差异无统计学意义(P>0.05)，而TNF-α mRNA的表达显著增高(P<0.05)；在注射LPS 24 h后，ADP的表达较正常对照组显著下降，而TNF-α mRNA的表达仍显著增高(P<0.05)，见表2。

表2 两组大鼠组织中ADP以及TNF-α mRNA的水平

2.4ADP以及TNF-α mRNA的水平与血浆中相应指标水平的相关性分析 通过对两者进行Spearman相关性分析，发现脓毒血症组大鼠组织中ADP mRNA水平与血浆中ADP的水平呈正相关(r=0.912，P=0.000)，TNF-α的相关性分析也呈相同的趋势(r=0.823，P=0.000)。

3 讨 论

目前对脓毒症的研究主要集中实验动物上，通常用对大鼠尾静脉注射LPS造模形成大鼠脓毒血症以供研究〔5,6〕。

ADP是一种由多种基因决定的内源性生物活性多肽。在多种研究中发现，一些患糖尿病、动脉粥样硬化、肥胖、冠心病的患者会表现出低ADP血症，提示ADP与代谢性疾病有一定的关系〔7，8〕。本研究说明ADP的水平在脓毒症这种急性炎症中出现下降，提示机体内ADP水平的高低可能影响了脓毒症的发生发展。

TNF-α是一种机体内常见的致炎因子，ADP在体内可以抑制TNF-α等致炎因子的表达，以减轻甚至终止炎性反应，在机体的免疫反应中也起着很重要的负性调节作用〔9,10〕。有研究表明，用药物提高脓毒血症大鼠血液中的ADP浓度可以提高大鼠的生存率，可能与其抑制炎症因子的表达有关。本研究说明在脓毒症大鼠的体内，ADP与TNF-α的变化方向相反，提示在体内两种因子的表达相互拮抗，ADP有潜在的抗炎作用。

综上，在脓毒症大鼠体内，ADP与TNF-α表达相互拮抗，可能在脓毒症的发生发展过程中起着重要的调节作用，在以后的治疗过程中，可能通过提高血浆和组织中ADP的浓度或者增加ADP受体的敏感度来改善脓毒症的治疗效果。

4 参考文献

1Xu L, Bao HG, Si YN,etal.Effects of adiponectin on acute lung injury in cecal ligation and puncture-induced sepsis rats〔J〕.J Surg Res，2013；183(2):752-9.

2Uji Y, Yamamoto H, Maeda K,etal.Adiponectin deficiency promotes the production of inflammatory mediators while severely exacerbating hepatic injury in mice with polymicrobial sepsis〔J〕.J Surg Res，2010；161(2):301-11.

3Vachharajani V, Cunningham C, Yoza B,etal.Adiponectin-deficiency exaggerates sepsis-induced microvascular dysfunction in the mouse brain〔J〕.Obesity (Silver Spring)，2012；20(3):498-504.

4吴艳春,黄立权,王灵聪,等.脓毒症患者血清脂联素水平的初步研究〔J〕.中华危重症医学杂志(电子版),2010；3(5):297-300.

5Robinson K, Prins J, Venkatesh B.Clinical review: adiponectin biology and its role in inflammation and critical illness〔J〕.Crit Care，2011；15(2):221.

6Robinson K, Kruger P, Prins J,etal.The metabolic syndrome in critically ill patients〔J〕.Best Pract Res Clin Endocrinol Metab，2011；25(5):835-45.

7Gil A, Olza J, Gil-Campos M，etal.Is adipose tissue metabolically different at different sites〔J〕? Int J Pediatr Obes，2011；6(1)：13-20.

8李 莎,鲍红光.脓毒症大鼠脂联素表达水平变化的实验研究〔J〕.中华临床医师杂志(电子版),2011；5(1):125-9.

9汤石林,符 晖,赵正亮,等.脓毒症患者血清脂联素水平及与炎症因子的相关性研究〔J〕.中国现代医学杂志,2011；21(15):1853-5，1858.

10Pini M, Castellanos KJ, Rhodes DH,etal.Obesity and IL-6 interact in modulating the response to endotoxemia in mice〔J〕.Cytokine，2013；61(1):71-7.