金雀异黄素诱导K562和K562/ADM细胞的凋亡作用

刘 润 郭 超 赵 英

(甘肃中医学院解剖教研室，甘肃 兰州 730000)

植物雌激素金雀异黄素(GS)是国内外公认的植物界抗癌成分的首选物质,其具有抑制多种肿瘤细胞生长、诱导多种来源肿瘤细胞凋亡的作用〔1，2〕。这主要与它的弱雌激素作用和抗雌激素样作用、抑制生长因子受体酪氨酸激酶活性、诱导细胞凋亡、干扰细胞周期等〔3〕有关，但其作用机制尚未完全阐明。肿瘤细胞发生凋亡抑制是肿瘤产生多药耐药的核心和本质，应用药物诱导肿瘤细胞凋亡已成为治疗肿瘤及耐药逆转的新途径〔4〕。本课题探讨GS诱导K562和K562/ADM细胞凋亡通路的可能分子机制。

1 材料与方法

1.1试剂 GS，纯度98%，用无水乙醇配成1×104μmol/L的贮存液，MTT、琼脂糖、溴乙啶(EB)、碘丙啶(PI)均为美国Sigma公司产品；DNA抽提试剂盒购自上海生工生物公司；鼠抗人Bcl-2单抗(即用型)、兔抗人Bax单抗(即用型)、免疫组化试剂盒均购自福州迈新生物公司。

1.2细胞培养 K562和K562/ADM细胞株由兰州大学医学实验中心提供。细胞接种于含15%新生小牛血清的RPMI 1 640培养液中，置37℃、饱和湿度、5%CO2孵箱中培养。定期加入阿霉素(3～6 g/ml)以维持其耐药性，去除阿霉素后继续培养2 w后用于实验。实验时均采用对数生长期细胞，实验中乙醇的最大终浓度为0.1%。

1.3MTT比色法 把细胞制成单细胞悬液，以密度1×104/ ml 200 μl /孔接种于96孔培养板中，对照组不加药，实验组在不同浓度的GS作用24、48、72 h后，每孔加入20 μl的MTT溶液(5 mg/ml)，继续孵育4 h，弃上清，加入150 μl DMSO，充分溶解结晶物，在酶标仪上于570 nm处测定吸光度值，计算细胞生长抑制率和IC50。

1.4流式细胞仪(FCM)分析细胞凋亡 各组收集处理48 h 2×106个细胞，PBS洗涤。制成单细胞悬液，70%冷乙醇固定过夜，PBS洗涤，PI染色，上机检测。

1.5亲和素-生物素-酶复合物(ABC)法观察Bcl-2和Bax蛋白表达 各组收集处理48 h 1×106个细胞，PBS洗涤,在细胞涂片离心机的样品容器中每孔加200 μl细胞悬液涂片(800 r/min,4 min)，丙酮固定。采用亲和素-生物素-酶复合物法(ABC),严格按试剂盒操作程序操作，DAB显色。PBS代替一抗设阴性对照。显色时镜下控制。脱水、透明、封片。结果判定：以胞核、胞质棕黄染色且背景清晰者为阳性信号，阳性细胞数≥25%为阳性。

2 结 果

2.1GS对细胞增殖的生长抑制作用 GS对K562及K562/ADM细胞增殖有明显抑制作用，对K562及K562/ADM细胞的生长抑制率与浓度呈正相关，GS对K562/ADM细胞的耐药倍数为1.67倍，说明K562/ADM细胞株是多药耐药表型的细胞系，提示K562细胞对GS比K562/ADM细胞敏感，K562/ADM细胞对GS同样存在耐药现象。见表1。

2.2FCM检测细胞凋亡 GS作用K562细胞，细胞凋亡率有时间与浓度依赖性，可见亚G1期细胞增多，GS 75 μmol/L时为27.3%，高于GS同浓度下作用K562/ADM细胞时的5.4%(P<0.05)，说明GS更易诱导K562细胞凋亡；S期细胞减少，G2M期细胞增多，提示细胞发生G2M期阻滞。而 GS作用K562/ADM细胞，细胞组间凋亡率没有明显变化，但细胞发生明显的G2M期阻滞。见表2。

2.3Bcl-2和Bax蛋白的免疫细胞化学检测结果 结果显示，不同浓度GS对K562细胞的Bax蛋白呈强阳性表达率100%，对照组几乎不着色；Bcl-2蛋白实验组同对照组比较颜色无明显变化；而在K562/ADM细胞中，Bcl-2在实验组和对照组中均强表达，但Bax的表达均无明显变化(图1、图2)。

表1 GS对K562细胞及K562/ADM细胞增殖的生长抑制作用

表2 GS对K562和K562/ADM细胞周期分布的影响

图1 各组K562细胞Bax蛋白表达(DAB,48 h,×400)

图2 各组K562/ADM细胞Bcl-2蛋白表达(DAB,48 h,×400)

3 讨 论

白血病细胞发生耐药的信号途径及调控机制仍不甚明了，凋亡抑制是白血病细胞耐药形成的重要机制之一〔5〕，凋亡调控蛋白Bcl-2和Bax是同一家族作用完全相反的蛋白，两者之间表达量的平衡关系决定细胞的生存或凋亡。Bcl-2是广义的抑制凋亡基因，而Bax是促凋亡基因，Bax/Bcl-2异二聚体或Bax/Bax同二聚体增高，将导致细胞凋亡〔6〕。细胞Bcl-2蛋白表达水平与肿瘤细胞对多种化疗药物敏感性和耐受性密切相关。本研究观察到K562/ADM细胞高表达Bcl-2蛋白，GS并不能诱导K562/ADM细胞Bcl-2蛋白表达发生明显变化，提示K562/ADM细胞的耐药性和凋亡抑制与Bcl-2蛋白高表达有关。GS通过上调Bax蛋白的表达量，下调Bcl-2蛋白的表达量，从而诱导K562细胞凋亡。本实验中，通过GS对白血病细胞的生长抑制和诱导凋亡作用，说明GS可作用于细胞周期信号系统，干扰细胞周期时相的协调进行，形成K562细胞对GS比K562/ADM细胞敏感，K562/ADM细胞对GS同样存在耐药的现象，提示GS主要通过生长抑制、干扰细胞周期、诱导细胞凋亡的方式抑制白血病细胞的增殖。GS作用的机制有助于临床克服抗肿瘤药物的耐药性提供新的途径。

4 参考文献

1Kousidou OC,Mitropoulou TN,Roussidis AE,etal.Genistein suppress the invasive potential of human breast cancer cells through transcriptional regulation of metalloproteinases and their tissue inhibitors〔J〕.Int J Oncol,2005;26(4)：1101-9.

2钟兴兰，王新娟，姚伟娟，等.金雀异黄素对小鼠红白血病细胞系MEL的抑制作用〔J〕.中国生物化学与分子生物学报，2003；19(1)：112-7.

3范玉贞,王玉华.金雀异黄素抗肿瘤作用的研究进展〔J〕.实用肿瘤学杂志,2008；22(1)：72-5.

4Johnstone RW，Ruefli AA，Lowe SW.Apoptosis：a link between cancer genetics and chemotherapy〔J〕.Cell Biochem，2002；108(2):153-64.

5Gadducci A，Cosio S，Muraca S，etal.Molecular mechanisms of apoptosis and chemsensitivity to platinum and paclitaxel in ovarian cancer：biological and clinical implications〔J〕.Eur J Gynaecol Oncol，2002；23(5):390-6.

6Yang LJ,Wang WL.Establishment of the hepatoma cells which express Bax protein Stably and highly and observation of its apoptotic phenomena〔J〕.J Fourth Mil Med Univ,2002；23(5):455-8.