电针联合贞芪扶正颗粒对肝纤维化大鼠自由基反应、NF-κB活化、TGF-β1和CTGF mRNA表达的影响

张超贤 郭李柯 郭晓凤

(新乡医学院第一附属医院消化内科，河南 卫辉 453100)

在肝脏损伤时,肝星状细胞(HSCs)受到各种致病因子的刺激，从静息状态化转为具有增生性、纤维原性和可收缩性的肌成纤维细胞， 后者产生大量细胞外基质(ECM)在肝脏沉积, 在肝纤维化发生、发展中起关键作用〔1〕。研究表明，自由基反应 、转化生长因子-β1(TGF-β1)和结缔组织生长因子〔2,3〕在促使HSCs增殖与活化，诱导肝纤维化过程中发挥重要作用，核因子(NF)-κB是一种核转录因子，能够被自由基反应产物、内毒素等因素激活，调节包括TGF-β1、结缔组织生长因子(CTGF)等多种基因的表达，间接参与肝纤维化的形成〔4〕。电针足三里等穴位及贞芪扶正颗粒具有益气扶正功能，从中医理论上推测可能应具有有良好抗肝纤维化作用。本实验通过电针联合贞芪扶正颗粒治疗二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化大鼠。

1 材料和方法

1.1材料 雄性SD大鼠, 3 月龄300 只，体重180～220 g(新乡医学院实验动物中心提供)，DMN(日本化成公司)， 将DMN 335 μl加0.15 mol/L 的氯化钠溶液中稀释至66.96 ml，制备腹腔注射液备用; 贞芪扶正颗粒(15 g/袋，山西德元堂药业有限公司生产，批准文号：豫药制字Z14020883)；凝胶成像系统扫描仪(UVP公司，美国)，Trizol试剂(美国Invitrogen公司)，TGF-β1、CTGF及β-actin引物(上海博亚生物技术有限公司)，RT-PCR(一步法)试剂盒(大连宝生物工程有限公司)。ROS 、SOD、GSH-Px、CAT 、T-AOC、 LPO检测试剂盒(南京建成生物工程公司)，NF-κB检测试剂盒(美国RD公司)。

1.2实验动物分组与模型制作方法 SD大鼠饲养笼饲养，自由饮水，标准饲料喂养。适应环境1 w后，随机分为五组：正常对照组、模型组、电针组、贞芪扶正颗粒组(蒸馏水稀释为0.15 g/ml)、针药联合组。每组60只大鼠。除正常对照组外，其余各组均给予上述DMN稀释液隔日1次按2 ml/kg腹腔注射，共4 w。电针组取双侧足三里、关元、内关、三阴交、肝俞穴，采用华佗牌30号寸毫针,针尖圆滑，针刺时大鼠固定为仰卧位，对上述穴位作常规消毒，术者右手持针，针体与皮肤呈90°刺入皮下，进针深度为0.5 cm，连接G6805电针治疗仪，将电针仪调整如下：调整输出调节旋钮置于1档(即输出电压为1 V保持不变)频率20 Hz，每次留针30 min，2次/d ，共4 w。贞芪扶正颗粒组予贞芪扶正颗粒稀释液2 ml/(100 g-1·d-1)分2次灌胃，针药联合组则予上述电针和贞芪扶正颗粒治疗。正常组和模型组予等量蒸馏水灌胃。在造模过程中模型组死亡2只，贞芪扶正颗粒组死亡1只。实验4 w后，乙醚吸入麻醉下麻醉下，处死动物并剖腹，取出肝脏并称重；在肝右叶位置切取小块组织，置入10%中性甲醛缓冲液固定。其余肝组织分装于离心管中低温保存。

1.3肝组织病理 取经10%中性甲醛缓冲液固定的大鼠肝组织，石蜡包埋，切片为5 μl厚度，多级酒精脱水，二甲苯透明，作网状纤维染色、Masson染色。肝脏纤维化程度分期标准参照文献〔2，3〕：0级:无纤维化;Ⅰ级:汇管区纤维化扩大,局限窦周及小叶内纤维化; Ⅱ级:汇管区周围纤维化,纤维间隔形成,小叶结构保留; Ⅲ级:纤维间隔伴小叶结构紊乱,无肝硬化; Ⅳ级:早期肝硬化。利用病理图像分析仪，对Masson染色胶原定量分析，首先设定窗口面积：每组至少选8个视野，测定窗口范围内的胶原面积。

1.4肝组织指标的测定 2%的肝组织匀浆10 000 r/min离心，1 min后取上清，4℃保存，分别按试剂盒说明书进行。活性氧族ROS含量测定采用Fenton反应显色法，抗氧化能力(T-AOC)比色法，超氧化物歧化酶(SOD)的测定采用黄嘌呤氧化法 , 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力测定用DTNB直接法,过氧化氢酶(CAT)紫外吸收法, 脂质过氧化物(LPO)含量的测定采用TBA比色法, ELISA法测定NF-κB。

1.5TGF-β1 mRNA的检测 在4 w末同组织学检查法取大鼠肝组织,剪成1 cm×1 cm×1 cm大小,储存于-80 ℃冰箱中，Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司)提取大鼠肝组织总RNA, 采用RT-PCR法检测TGF-β1 mRNA，TGF-β1 mRNA引物序列:上游5'-GGACTACTACGCCAAAGAAG-3'，下游5'- TCAAAAGACAGCCACTCAGG -3'，扩增产物长度294 bp，内参β-actin序列：上游5'- GTGCCCATCTACGAGGGTTA -3'，下游5'-TCTCAGCTGTGGTGGTGAAG -3'，扩增产物长度730 bp。PCR条件：94 ℃预变性5 min， 94 ℃变性30 s，退火TGF-β1为54 ℃，β-actin为55 ℃，72 ℃延伸60 s， 30个循环,最后 72 ℃延伸10 min，取PCR反应液8 μl进行琼脂糖凝胶电泳，分析PCR产物，测定扩增带(目的条带和β-actin)的吸收度值，计算TGF-β1 mRNA与β-actin的吸光度比值。

1.6肝组织CTGF mRNA检测 Trizol试剂盒提取大鼠肝组织总RNA, CTGF上游引物: 5'-CGGGAAATGCTGTGAGGAGT -3'，下游引物5'-CAGGCTTGGCAATTTTAGGC -3'，扩增产物长度326 bp；β-actin引物序列为上游引物: 5'-GAG CGT GGC TAC AGC TTC AC-3'，下游引物5'-GGATGC CAC AGG ATT CCA TA-3'，扩增长度120 bp。PCR反应体系为20 μl,PCR循环参数为:94℃预变性3 min;94 ℃变性30 s,54 ℃退火30 s，72 ℃复性30 s，共35个循环，最后72 ℃延伸7 min。每次PCR反应均以无菌双蒸水代替cDNA模板作为阴性对照。取7 μl PCR产物在15 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳，紫外线下观察结果，并在凝胶电泳分析系统下拍照。求出每条带的密度值，以β-actin PCR产物作为内参照。求出每条目的条带与β-actin条带的比值，进行统计学处理。

2 结 果

2.1病理学表现 正常组肝细胞排列整齐，胞质均匀，肝小叶及小叶中央静脉完整，轮廓清楚，肝细胞索网状纤维结构完整。模型组肝脏广泛肝细胞脂肪变性、坏死，多数汇管区有淋巴细胞、单核细胞至汇管区向邻近肝小叶内浸润，同时小叶内大范围坏死塌陷；各治疗组可见肝组织内炎症细胞浸润、肝细胞坏死和纤维组织增生较模型组减轻，纤维间隔较薄(图1，图2)。各组肝组织纤维化分期、Masson染色胶原纤维面积比较(表1)。

2.2电针和贞芪扶正颗粒对大鼠肝组织ROS和LPO含量、T-AOC、SOD、GSH-Px、CAT及NF-κB活性、TGF-β1 mRNA及CTGF mRNA表达的影响 模型组肝组织ROS、LPO含量、NF-κB活性、TGF-β1 mRNA及CTGF mRNA较正常对照组显著增高，T-AOC、SOD、GSH-Px、CAT活性显著降低(P<0.01)，治疗组ROS、LPO含量、NF-κB活性、TGF-β1 mRNA及CTGF mRNA明显低于模型组，T-AOC、SOD、GSH-Px、CAT活性显著升高(P<0.01)，联合治疗组治疗效果优于单治疗组(P<0.05)，NF-κB活性与TGF-β1 mRNA及CTGF mRNA呈正相关关系(r=0.627，P< 0.05；r=0.581，P< 0.05)(表2、图3)。

正常对照组

模型组

电针组

贞芪扶正颗粒组

针药联合组

正常对照组

模型组

电针组

贞芪扶正颗粒组

针药联合组

表1 各组大鼠肝组织纤维化分期、染色胶原纤维面积比较

表2 各组大鼠肝组织ROS和LPO含量、T-AOC、SOD、GSH-Px、CAT及NF-κB活性、TGF-β1 mRNA及CTGF mRNA表达的比较

M：Marker；1：正常对照组； 2：模型组；3：电针组; 4: 贞芪扶正颗粒组;5：针药联合组

图3各组肝组织TGF-β1、CTGFmRNA的表达

3 讨 论

大量研究发现肝细胞受损时ROS含量明显增高，ROS能攻击生物膜磷脂中的多聚不饱和脂肪酸发脂质过氧化反应，形成 LPO，所以LPO在体内的含量反映了脂质过氧化的程度和速率， LPO可通过诱导炎性细胞浸润, 激活Kuppffers细胞和HSCs, 引发肝纤维化。SOD 是体内存在的一种抗氧化酶 , 能将氧自由基歧化为 H2O2, H2O2进一步在 CAT 、GST-Px 的催化下被清除 ,从而保护细胞免受损伤〔5〕。T-AOC的作用主要是维持内环境活性氧的动态平衡，使机体处于氧化还原相对稳定的状态，其大小可代表和反映机体抗氧化酶系统和非酶促系统对外来刺激的代偿能力以及机体自由基代谢的状态〔6〕。包括酶促与非酶促两个体系：酶促体系有SOD、GSH-PX、CAT、谷胱甘肽S-转移酶(GST)等。联合测定ROS、T-AOC、SOD、GST-Px 、CAT、 LPO能了解自由基反应与脂质过氧化与疾病的关系，可作为疾病的诊断、预后和抗氧化治疗的一个有用指标。

TGF-β1 是目前已知致纤维化最强的因子 ，可以促使活化肝星状细胞(HSC)和纤维母细胞生长 ，同时 HSC能 自分泌TGF-β1，是肝纤维化后期TGFβ1的主要来源，导致细胞外基质循环不断产生，从而导致肝纤维化的发生〔7〕。CTGF是一种与肝纤维化密切相关的促纤维化细胞因子，在慢性肝病患者及实验性动物肝组织中，CTGF表达水平增高，并与肝纤维化记分呈正相关。CTGF可介导TGFβ1、血管内皮生长因子(VEGF)、脂质过氧化物等多种信号刺激的促纤维化作用，可促进包括HSCs在内的多种纤维活性细胞合成并分泌ECM〔8〕。 NF-κB是一种具有多向转录调节作用的蛋白, 在静止期细胞的胞质中，NF-κB处于P50、P65与抑制蛋白IκB结合的多聚体非活化状态。当细胞受到细菌、病毒、活性氧、过氧化脂质、化疗药物等外源性刺激时，多聚体上的IκB磷酸化降解，NF-κB活化，进入细胞核内与特定基因启动因子区域位点结合，启动免疫相关受体、细胞因子、炎症因子、黏附分子等靶基因的转录，产生大量的包括TGFβ1、VECG、CTGF、TNF-α等细胞因子〔9,10〕。

综上，氧自由基和脂质过氧化物可能是NF-κB重要刺激物，可活化NF-κB，促进CTGF等相应基因的转录，LPO不仅可活化Kupffer细胞，分泌TGF-β1等细胞毒性因子，继而激活HSCs，还能直接激活HSCs，而活化的HSCs是CTGF主要来源，TGF-β1也可促进CTGF的转录，CTGF反过来又可介导TGFβ1、脂质过氧化物等多种信号刺激的促纤维化作用，可促进包括HSCs在内的多种纤维活性细胞合成并分泌ECM ，所以在肝纤维化发生、发展过程中，自由基反应、NF-κB、 TGF-β1和CTGF是相互协同、相互促进的，形成一种正反馈网络， 因此若能抑制脂质过氧化、抑制NF-κB活化，下调TGF-β1及CTGF表达，则有希望减少HSCs活化、增殖和胶原的沉积达到发挥抗纤维化的作用。

肝纤维化属于祖国医学“胁痛”,“症积”,“瘀血”等范畴。其病因为:情志郁结,气失条达;饮食不节,嗜酒过度,虫积水毒所伤及病后继发。以上病因致使肝脾内伤,肝失疏泄,脾失健运,肝郁气滞,而使血行不畅,久则血瘀络阻。故正虚血瘀是肝纤维化的基本病机，贞芪扶正颗粒是采用黄芪、女贞子等中药为主要原料，提取有效成分，研制而成，具有扶正固本、益气补虚、活血化瘀的功效。从中医理论上贞芪扶正颗粒应具有良好的抗肝纤维化作用。现代药理研究已证明：黄芪甲苷可阻止TNF-α、细菌脂多糖 诱导NF-κB的核移位与靶基因的κB位点的结合，抑制 TGF-β1、CTGF基因的转录〔11〕；黄芪总黄酮和黄芪总皂苷清除自由基的主要机制是结构中的酚羟基类基团在与氧自由基作用时，通过提供氢原子，发生氧化还原反应而发挥作用〔12〕。另褪黑素是强有力的内源性抗氧化剂，其抗氧化作用包括直接清除自由基，间接刺激抗氧化酶活性及基因表达，刺激谷胱甘肽合成、减少线粒体电子传递链电子渗漏、和其他抗氧化剂有协同效应，而黄芪总皂苷则可促进机体褪黑素分泌或加强其与受体结合而增强机体的抗氧化能力〔13，14〕；黄芪有效成分黄芪多糖、硒、木糖-葡萄糖-环黄芪醇可启动DNA修补酶、刺激抗体产生、清除有害自由基 ，启动使谷胱甘肽过氧化物酶、阻止黄嘌呤及黄嘌呤酶的氧化损伤发挥抗氧化作用〔15〕。

针刺穴位可激发经络本身协调阴阳的功能，泄其有余，补其不足，阴阳平复，达到调整虚实防治疾病的作用。现代研究表明，神经内分泌系统与免疫系统之间有密切的双向调节联系。免疫细胞上有多种神经内分泌激素受体，多种激素会影响免疫功能，免疫细胞也可合成神经递质和激素影响内分泌系统，神经-内分泌-免疫系统紊乱参与肝癌发病。针刺可影响神经内分泌激素和细胞因子的生成和表达，双向调节神经-内分泌-免疫网络，使异常机能向有利于机体的方向转化。有研究表明针灸对提高免疫系统机能的调整功能是扶正的物质基础，又是除邪的物质条件，表明针灸"补虚泻实、扶正祛邪"的理论是科学的，其调整功能是可靠的。现代针灸机制研究表明针刺足三里、关元、内关、三阴交等穴可明显提高大鼠SOD、GSH-Px、CAT活性，清除自由基，抑制脂质过氧化物的生成〔16～19〕。

本研究进一步印证了自由基反应、脂质过氧化、NF-κB异常活化TGF-β1及CTGF高表达在肝纤维化中的作用；研究说明电针和贞芪扶正颗粒均能提高机体抗氧化能力，降低自由基产和脂质过氧化物的生成，抑制 NF-κB的活化，下调TGF-β1 mRNA及CTGFF mRNA表达，打破了自由基反应-NF-κB的活化-TGF-β1 mRNA促纤维化的正反馈机制，从而达到抗纤维化目的，这与现代医学所揭示的针刺和贞芪扶正颗粒的作用机制相符；另本研究发现，电针和贞芪扶正颗粒联合应用时效果更佳，提示两者在治疗肝纤维化时可起协同作用，为临床针药联合治疗肝纤维化提供了理论和实验依据。

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