重组人粒细胞集落刺激因子动员骨髓干细胞对大鼠脑梗死血管新生的影响

王 宇 王 燕 王 波 史小琴 张明艳 张建丽 许文杰

(河北大学基础医学院，河北 保定 071002)

脑梗死是严重威胁人类健康的疾病之一，其致残和致死率均较高〔1〕。目前治疗手段无法修复或逆转坏死的脑组织，更不能促进血管和神经再生，且因适应证和并发症的限制，溶栓治疗并未取得良好疗效。缺血性梗死虽然诱导内源性干细胞增殖，但产生的自身修复作用有限。本课题组利用细胞因子(趋化因子)使骨髓干细胞进入外周血，并在特定的组织微环境下分化为受损细胞的特性〔2〕，达到修复缺血损伤的作用。本研究利用重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)动员骨髓干细胞治疗大鼠脑梗死模型，探讨骨髓干细胞能否在脑梗死的特定环境中发挥保护作用并促进血管新生，为治疗脑梗死寻找更有效的治疗方法提供依据。

1 材料和方法

1.1实验动物与分组 健康雄性SD大鼠(清洁级)共150只，体重300～400 g。在SPF恒温恒湿条件下饲养，并随机分为模型动员组、模型组、假手术组，每组50只。在大脑中动脉闭塞模型建立后，于24、48、72 h、1 w和1个月五个不同时间点对各组的10只(n=10)大鼠分别处死。在处死前对不同时点的各组10只大鼠进行神经功能Longa评分〔3〕。

1.2主要药物与试剂 rhG-CSF：武汉博士德生物工程有限公司；抗大鼠CD34、VEGF和Flk-1单抗：北京中杉科技有限公司；抗大鼠Ⅷ单抗：北京博奥森生物技术有限公司。

1.3大脑中动脉闭塞模型的建立 在无菌条件下，用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉SD大鼠。取仰卧位固定和消毒术野，颈正中线切口并分离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，在CCA远心和近心端及ECA挂线备用；用微动脉夹夹闭ICA，近心端结扎CCA、ECA；在距CCA分叉处3～5 mm剪一小口，将拴线插入到CCA，这时用绕在CCA远心端的细线轻轻系牢拴线。用眼科镊轻推拴线，从血管分叉处开始算距离，当插入深度在18 mm时，送线至刚有阻力感时停止进线，紧紧系牢CCA远心端的细线，扎紧切口处之活结备线，外留1 cm长线头，缝合皮肤。Longa评分：再灌注2 h后，按照5分法分级(0分：无神经缺损症状；1分：对侧前肢不能完全伸直；2分：向对侧旋转；3分：向对侧倾倒；4分：不能自己行走或昏迷)。1～4分为大鼠模型成功建立的标志。

1.4检测指标 腹腔注入过量麻醉剂致死后，碘酒和酒精消毒，快速断头并将头皮充分分离；然后从近颈部开始分离头骨，咬骨钳迅速掀去颅骨，眼科剪分离神经，最后将大脑完整分离。脑梗死面积：脑组织冷冻后选取肉眼下梗死明显部分制成苏木素-伊红(HE)染色组织病理切片，每只大鼠制作3张，光学显微镜下记录最大梗死灶长度及宽度，长度×宽度即为梗死灶面积。微血管密度：以Ⅷ因子阳性表达为微血管所在区域，主要发生在梗死灶周围。免疫组化结果均使用image pro-plus软件进行分析。

2 结 果

2.1神经功能分级 骨髓干细胞动员后24 h，模型组与模型动员组Longa评分未见明显差异(P>0.05),但均优于假手术组；在48 h、72 h、1 w和1个月后，模型动员组明显优于模型组(P<0.05)，而假手术组未见明显神经功能改善；且模型动员组改善情况更为明显(P<0.05)。见表1。

2.2脑梗死面积测定 假手术组未见梗死区，模型组和模型动员组梗死面积均大于假手术组(P<0.05)；而模型动员组梗死面积不同时间点均小于模型组(P<0.05)；且发现两组在不同时间梗死面积变化趋势各异，模型组呈缓慢增加，而模型动员组逐渐减少，且在72 h和1 w时间点梗死面积与前一时间点比较有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3微血管密度 两组微血管密度均大于假手术组(P<0.05)；模型动员组在各时间点均表达大于模型组(P<0.05)；且在模型动员组中发现，48 h比24 h时间点的Ⅷ因子表达明显增加(P<0.05)。见表3。

表1 各组不同时间点Longa评分比较

表2 各组不同时间点脑梗死面积比较

表3 各组不同时间点Ⅷ因子表达情况比较

3 讨 论

虽然机体在脑缺血应激状态下可促进生成微血管，本实验也证实了这点，但远不能达到治疗和改善病情的目的，且目前治疗方式局限，不能得到很好的治疗效果。血管内皮系统是血管新生的根本途径，而血管生成因子参与的信号传导起决定性作用〔4〕。

粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是调节骨髓粒系造血的重要细胞因子。体外实验发现G-CSF可诱导中性粒细胞分泌血管生成因子〔5〕。大鼠经G-CSF治疗后内皮细胞增殖和梗死区血管密度均显著高于对照组，且其具有同时动员造血干细胞和间充质干细胞的能力，所以G-CSF动员骨髓造血干细胞的同时也动员了内皮前体细胞〔6〕。实验证明，G-CSF在体内、体外均可促进内皮前体细胞的生长、增殖和迁移，从而增加缺血区域组织的血管新生〔7〕。因此，应用骨髓干细胞动员治疗脑梗死成为可能。本研究发现，使用了rhG-CSF的模型动员组无论在血管新生、微血管密度、梗死面积，还是神经功能等方面均有明显改善，但随治疗时间推移，血管新生不能看到明显的变化，这可能与机体对药物抵抗等有关，但具体机制有待进一步研究。陈运贤等〔8〕用G-CSF动员自体骨髓干细胞治疗大鼠急性脑梗死的实验发现，G-CSF治疗梗死体积明显小于对照组,病理损伤也轻于对照组，提示G-CSF动员可能对缺血性脑梗死有保护作用，术后48 h在脑梗死灶中只发现CD34阳性的单个核浸润，这一结果也与本研究一致。脑梗死的干细胞动员，其具体治疗效果还需大量实验和临床研究来证实。

4 参考文献

1Kalaria RN. Cerebrovascular disease and mechanisms of cognitive impairment: evidence from clinicopathological studies in humans〔J〕. Stroke,2012;43(9): 2526-34.

2靳凤艳,邱录贵,李桥川,等. 基质细胞衍生因子-1及其受体在G-CSF诱导的造血干/祖细胞动员中的作用〔J〕. 中华血液学杂志,2007;28(2)：98-102.

3赛音巴雅尔,林贵军,饶芝国. 外源性血管内皮生长因子对大鼠脑血肿周围血管新生及神经功能恢复的影响〔J〕. 中华神经外科杂志,2012;28(5)：522-5.

4Emanueli C,Madedu P. Angiogenesis gene therapy to rescue ischaemic tissues: achievements and future directions〔J〕. Br J Pharmacol,2001;133(7): 951-8.

5Ohki Y,Heisssig B,Sato Y. Granulocyte colony-stimulating factor promotes neovascularization by releasing vascular endothelial growth factor from neutrophils〔J〕. FASEB J,2005;19(14): 2005-7.

6Lee ST,Chu K,Jung KH,etal. Cranulocyte colony-stimulating factor enhances angiogenesis after focal cerebral ischemia〔J〕. Brain Res,2005;1058(1-2): 120-8.

7刘宏伟,盖鲁粤,张端珍,等. 骨髓干细胞动员与移植治疗心肌梗死的比较〔J〕. 中国病理生理杂志,2006;22(4):674-7.

8陈运贤,陆 英,钟雪云,等. 粒细胞集落刺激因子动员骨髓干细胞治疗大鼠缺血性脑梗死〔J〕. 中国病理生理杂志,2004;20(4):560-5.