六味地黄丸对2型糖尿病大鼠坐骨神经组织胰岛素样生长因子-1 mRNA和神经生长因子mRNA表达的影响

何建华 胡明财 孙玉红 秦超超 李晓冰

(泸州医学院附属医院内分泌科，四川 泸州 646000)

糖尿病周围神经病变 (DPN)是2型糖尿病(T2DM)主要并发症，也是患者致残的常见原因, 60%～90%的患者通过神经功能检查, 均有不同程度的神经病变〔1〕。六味地黄丸出自宋·钱乙的 《小儿药证直诀》, 是滋补肝肾的著名方剂。本实验观察T2DM大鼠坐骨神经组织神经营养因子(NGF)的表达，探讨六味地黄丸对DPN治疗作用的机制。

1 材料与方法

1.1药物与试剂 链脲佐菌素(STZ)，批号：120112，美国Sigma公司生产；六味地黄丸，批号：120142，河南宛西制药股份有限公司；糖末宁颗粒，批号：20120903，辽宁奥达制药有限公司；胆固醇，批号：120920；胆酸钠，批号：120920，上海蓝季科技发展有限公司。总RNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；批号：201211；RT逆转录试剂盒，大连宝生物工程有限公司；琼脂糖 美国Sigma；DNA Marker 天根生化科技(北京)有限公司；批号：201211。

1.2仪器 电子天平FA1604N,0.1 mg,上海民桥精密科学仪器有限公司。微孔板检测系统 Sepctra Max M3，美国 Molecular Devices；ND-1000微量紫外可见分光光度计，美国Nanodrop公司； 全自动酶标仪WD-2102A型, 杭州汇尔仪器；ECHNE TC-412PCR仪，英国TECHNE；漩涡混合器，上海青浦沪西仪器厂XW-80A；ChampChemi系列化学发光、荧光凝胶成像系统，北京赛智；电泳仪、电泳槽，美国Bio-Rad。

1.3动物模型的建立与分组给药 SD大鼠，雄性，体重130～150 g,SPF级，购自重庆滕鑫比尔实验动物研究所，许可证号：SCXK(渝)2007-0006。 大鼠80只适应喂养7 d后，随机分为对照组和造模组。对照组喂养普通饲料，用高脂高糖饲料饲喂造模组(2.5%胆固醇、10%猪油、20%蔗糖、1%胆酸钠，其余66.5%为基础饲料)饲养8 w；后空腹12 h，按照剂量20 mg/kg腹腔注射STZ(临用前配制，溶于0.1 mol/L、pH=4.2的无菌柠檬酸缓冲液)，对照组注入等容量柠檬酸缓冲液。72 h后检测所有大鼠的空腹血糖(FPG)值,称取大鼠体重测量体长，并用lee指数公式(Lee指数=〔体重(g)×103/体长(cm)〕1/3)计算大鼠体重指数(BMI),以BMI明显高于对照组大鼠和FPG>11.0 mmol/L双重指标为大鼠模型成功标准。选择造模成功的大鼠，随机分为模型组、糖末宁组(人体等效剂量)、六味地黄丸中剂量(为人体等效剂量)，六味地黄丸低剂量(1/2倍等效剂量)、六味地黄丸高剂量(2倍等效剂量)并设置正常对照组，每组大鼠10只。成模大鼠稳定1 w后开始灌胃给药。称取大鼠体重并标记后按人体与大鼠体表面积比值表换算出大鼠的等效剂量〔2〕，各干预组灌胃相应药物，正常对照组及模型组灌胃等容积生理盐水，1次/d，连续8 w。

1.4大鼠坐骨神经组织NGF及胰岛素样生长因子(IGF)-1的RT-PCR测定

1.4.1组织匀浆 给药8 w后，动物做其他指标检测后处死，取其坐骨神经组织，将组织在液氮中快速磨碎，然后按照剂量1 ml/100 mg加入裂解液RZ，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过裂解液RZ体积的1/10。将加入RZ裂解液的匀浆液在室温15～30℃温度下放置5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。

1.4.2总RNA提取 将样品装于EP管中，按照4℃ 12 000 r/min离心5 min，取上清移到另一个无RNase的1.5 ml的EP管内，再往此EP管内加入200 μl氯仿，盖好管盖，振荡15 s室温放置3 min。再于4℃12 000 r/min离心10 min，小心吸取上层无色的水相。再把水相移至另外一个无RNase的1.5 ml EP管内。缓慢加入约为水相0.5倍体积的无水乙醇，混匀，转入吸附柱CR3内，接入2 ml的收集管内，4℃12 000 r/min离心30 s，弃上清。向吸附柱CR3中加入500 μl去蛋白液RD，于4℃12 000 r/min离心30 s，弃上清。再向吸附柱CR3中加入700 μl漂洗液RW，温室静置2 min，后于4℃12 000 r/min离心30 s，弃上清。重复以上操作，于超净台上通风1 min，予以充分晾干。将吸附柱CR3转入一个新的收集管内，加入50 μl的RNase-free ddH2O，室温放置2 min充分溶解RNA，后于4℃12 000 r/min离心2 min。在-80℃冰箱保存所提取的RNA。用ND-1000微量紫外可见分光光度计检测所提取的RNA浓度。

1.5逆转录 按试剂盒操作，配制逆转录体系。取总RNA 5 μl (1 μg /μl) 加入5 μl Oligo(dT) 18(1 μg /μl) ,70℃变性5 min后置于冰上, 加MgCl24.0 μl ，10×RT 缓冲液2.0 μl ，dNTP 混合物2.0 μl, 无酶H2O 9.5 μl ，RNase 抑制剂0.5 μl，Random 9 mers 1.0 μl ，AMV 反转录酶1.0 μl，总反应体系25 μl, 混匀后依次置于30℃10 min、50℃30 min、99℃5 min，5℃5 min反应环境, 最后置于冰上。

1.6引物设计与合成 NGF上游引物5′-CGGCTTTGGTGACTGGATAG-3′，下游引物5′-TGAGGACCAGAGCAGACAGG-3′；IGF-1 上游引物5′-GCACCTCCAATAAAGATACAC-3′，下游引物5′-AACTGAAGAGCGTCCACC-3′，内参β-actin上游引物5′-AAACTCGGCACAGTT ATT-3′，下游引物5′-TATACAGCCTAGCATCCC-3′。以上引物由上海生物有限公司合成。

1.7PCR扩增 取逆转录产物5 μl进行PCR 反应，加入反应缓冲液5 μl (含Mg2+) ，dNTP(10 mmol/L) 2 μl,Taq 酶(5 U/μl)1 μl , 引物( 25 pmol/μl) 1 μl, 去离子水25 μl, 总反应体积为40 μl。放入PCR 仪, 分别执行下列反应程序: NGF: 94℃30 s、56.8℃ 30 s、72℃2 min；IGF-1∶94℃30 s、53.7℃ 30 s、72℃2 min,扩增30个循环, 72℃延伸6 min； β-actin：94℃30 s、56℃ 30 s、72℃2 min扩增30 个循环，72℃延伸6 min。

1.8电泳及图像分析 取5 μl的PCR产物，加1 μl的上样缓冲液，加入琼脂糖制备的凝胶板的样品孔内，110 mV 电泳30 min。应用凝胶成像系统观察扫描，实验结果应用Bio-Rad 公司Quantity One软件分析，测定电泳条带的平均灰度值，计算实验各样本NGF、IGF-1和β-actin电泳条带的光密度值比。

1.9统计方法 采用SPSS13.0软件进行多样本间单因素方差分析和两样本间t检验。

2 结 果

2.12型糖尿病大鼠造模结果 造模组大鼠FPG〔(16.99±3.62)mmol/L〕明显高于空白对照组〔(5.72±0.50)mmol/L〕(P<0.01)，各造模组大鼠BMI与空白对照组相比〔(311.53±19.01) vs (288.48±26.89) g/cm〕明显升高(P<0.01)。

2.2大鼠坐骨神经组织IGF-1 mRNA和NGF mRNA的PCR电泳结果 扩增后得到β-actin 450 bp和IGF-1 137 bp两个片段，内参β-actin与IGF-1/NGF的扩增条件完全一致。见图1。

a，高剂量组；b，中剂量组；c，低剂量组；d，模型组；e，空白对照组；f，糖末宁组

a，空白对照组；b，模型组；c，低剂量组；d，中剂量组；e，高剂量组；f，糖末宁组

2.3药物对T2DM大鼠坐骨神经组织IGF-1 mRNA和NGF mRNA相对表达的影响 模型组大鼠与空白对照组相比，IGF-1 mRNA，NGF mRNA与β-actin光密度值之比明显降低(P<0.01)。六味地黄丸高剂量组和糖末宁组与模型组相比，IGF-1 mRNA、NGF mRNA与β-actin光密度值之比明显升高(P<0.01)。见表1。

表1 各组坐骨神经NGF、IGF-1 mRNA相对表达量比较

3 讨 论

T2DM患者慢性并发症以DPN最常见。DPN的发病机制不明，存在多种假说。目前认为主要与高血糖引起的代谢紊乱、微血管病变、神经营养因子缺乏、氧化应激损伤有关，然而无论是何种致病因素, 最终的结果都是引起神经元及神经纤维的变性和坏死, 出现周围神经修复再生的障碍〔3〕。其基本病理改变包括节段性脱髓鞘、轴突变性、神经纤维缺失及神经纤维再生迟滞等。神经病变可累及感觉神经、运动神经及自主神经, 产生疼痛、麻木、运动障碍及自主神经功能障碍〔4〕。

NGF是最早发现的细胞生长调节因子, 对神经系统的正常发育、分化及再生有重要的生物学意义〔5，6〕。NGF由自主神经和感觉神经的靶器官合成, 并经神经轴突逆向转运至神经元胞体, 在神经元的发育、轴突的生长递质的合成及细胞的凋亡等阶段均起着重要作用，目前的研究显示NGF参与DPN的发生与发展,并正逐步证实神经组织修复再生能力受损与局部NGF合成分泌减少以及沿轴突逆行运输能力下降直接相关。IGF-1是另一种NGF, 已有研究表明神经自分泌或旁分泌组织IGF-1基因下调, 可能参与了DPN 的发生〔7〕。

被誉为“补阴方药之祖”的六味地黄丸，由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、丹皮、茯苓6味中药组成，其治疗糖尿病及糖尿病并发症的临床应用已有悠久的历史，薛江博〔8〕、段晓丽〔9〕也发现六味地黄丸对DPN患者有较好疗效。本实验结果提示T2DM大鼠模型复制成功。高剂量六味地黄丸能降低大鼠血糖水平从而改善糖尿病症状，减轻神经组织损伤；同时还可明显提高大鼠坐骨神经组织NGF及IGF-1 mRNA的表达，从而促进病变神经组织的修复，一定程度改善临床DPN患者的症状。六味地黄丸治疗DPN的机制与降低血糖水平、增加局部IGF-1的分泌有关。

4 参考文献

1刘硒碲,夏 宁.糖尿病周围神经病变研究进展〔J〕.广西医科大学学报,2010;27(2):317-9.

2黄继汉，黄晓晖，陈志扬，等.药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算〔J〕.中国临床药理学与治疗学，2004;9(9):1069-72.

3Dobretsov M,Romanovsky D, Stimers JR. Early diabetic neuropathy : Triggers and mechanisms 〔J〕.World J Gastroenterol, 2007; 13(2 ) : 175-91.

4刘冬恋.六味地黄丸治疗糖尿病及其并发症的研究〔J〕.四川生理科学杂志，2009;31(1)：31-4.

5石 敏,李剑波.糖尿病神经病变发病机制研究新进展〔J〕.中华临床医师杂志(电子版),2011;5(1):186-8.

6王 巍，于世家，于彩娜.糖末宁颗粒剂对糖尿病周围神经病变大鼠坐骨神经NGF、IGF-1表达的影响〔J〕.北京中医药大学学报，2010;33(5):346-7.

7耿介立.胰岛素生长因子-1与神经系统疾病〔J〕. 脑与神经系统疾病, 2004;12(3): 232-3.

8薛江博. 六味地黄联合黄芪桂枝五物汤治疗糖尿病周围神经病变的临床研究〔J〕. 中国当代医药,2010;17(33):101,136.

9段晓丽.六味地黄丸的药理作用与临床应用〔J〕.山西医药杂志，2009;38(12):1156.