DcR3在预防博莱霉素大鼠模型发生肺纤维化中的作用

杨 洋 任 锦 刘 晶 马忠森

(天津市胸科医院，天津 130051)

肺纤维化一般指在毒物、自发免疫反应、药物副反应、感染、严重的外伤等不同因素刺激下引起肺部炎症反应，肺泡持续性损伤、细胞外基质反复破坏、修复、重建并过度沉积，导致正常肺组织结构改变、功能丧失的一类疾病，发病率逐年升高。肺纤维化的发生通常经历肺泡炎和肺纤维化形成两个阶段，如果炎症阶段得到有效的抑制，势必延缓或阻止肺纤维化的形成。但现有的抗炎药物不能阻止肺纤维化的发展，有的甚至在抗炎的同时反而加重了肺纤维化的程度 。而近年来，DcR3在抗炎方面的研究备受关注，DcR3可能成为一个连接炎症、 固有免疫、 肿瘤的中间点〔1〕。本文将采用DcR3蛋白尾静脉注射干预肺纤维化早期动物模型，观察其对炎症反应的作用及其在预防纤维化方面的作用。

1 材料与方法

1.1实验动物 雌性健康Wistar大鼠72只，平均体重250～300 g，购自吉林大学基础医学院动物中心，随机分为三组，每组24只，分别为博莱霉素组、博莱霉素+ DcR3组、正常对照组。博莱霉素(日本化药株式会社生产)；DcR3蛋白(Sigma 美国)；大鼠肿瘤坏死因子(TNF)-α检测试剂盒购自晶美生物公司；OligodT、禽成髓细胞增生疾病毒(AMV)逆转录酶购自Promega公司；TRIZOL、焦碳酸二乙酯(DEPC)、氯仿、异丙醇、dNTP、Taq DNA聚合酶购自大连宝生物公司。

1.2方法

1.2.1动物模型的制作与分组 以3%戊巴比妥钠(0.4 ml/100 g体重)腹腔内注射麻醉，博莱霉素溶液(1.375 mg/ml)按5 mg/kg经气管呈45°角注入大鼠肺内，左右来回旋转并按摩双肺10余次，使药液尽可能在双肺内均匀分布，手术后置于动物实验室内喂养，分笼饲养，标记号分组。同样方法，正常对照组推注等容积的生理盐水。正常对照组大鼠活泼好动，体格随饲养时间延长更加肥硕，皮毛光泽发亮，呼吸平稳。博莱霉素组造模后3 d开始出现动作缓慢、呼吸急促、进食少；随着时间的延长出现精神萎靡、喜蜷缩、体重明显下降、皮毛色泽晦暗无光，死亡率较高。博莱霉素+DcR3组大鼠在造模后3～7 d也出现动作缓慢、呼吸急促，进食少但随着注射DcR3，情况改善，2 w后活动明显增多、进食恢复、呼吸恢复，体重逐渐增长，4 w后与正常对照组无明显区别。正常对照组：自模型制作当天开始每天给予尾静脉注射1 ml生理盐水；博莱霉素组：自模型制作当天开始每天给予尾静脉注射1 ml生理盐水；博莱霉素+ DcR3组：自造模当天开始按3.33 μg /kg 给予DcR3蛋白(1 μg/μl)1 ml，1次/d，尾静脉注射，给药时间2 w。

1.2.2标本制备 各组分别于2、4、6、8 w处死大鼠6只：大鼠称重后以3%戊巴比妥钠腹腔麻醉，结扎左支气管，分4次共注入磷酸盐缓冲液(PBS) 6 ml边按摩胸部边回收液体，离心1 500 r/min 10 min，收集上清冻存待检测TNF-α；重悬细胞计数并立即用于RT-PCR检测TNF-α mRNA的表达。取左肺组织冻存留作羟脯氨酸检测；取右肺组织浸入10%中性甲醛液中固定，石蜡包埋、切片以备用组织染色。

1.2.3肺泡灌洗液细胞计数 用吸管吸5滴细胞悬液到离心管中，将细胞悬液滴入计数板：统计4个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的4个大格(每个大格含有16个中格)中的细胞数目。

1.2.4肺泡灌洗液中TNF-α mRNA及上清中含量的检测 将重悬后BALF细胞转移EP管中离心，去上清加入1 ml Trizol，提取RNA，测定RNA浓度：加99 μl三蒸水混匀稀释，美国惠普可见/紫外光光度仪比色测OD值，A260/280在1.8～2.0之间。总RNA浓度(μg/ml)=OD 260×40×稀释倍数。选取比值在2.0左右的RNA样本做逆转录。逆转录反应体系：1 μl DEPC水、1 μl引物加入10 μl模板RNA→稍离心，100℃沸水1 min→加入2 μl dNTP Mix、4 μl 5×buffer、2 μl AMV逆转录酶→稍离心，42℃水浴90 min→沸水3 min 灭活AMV→-20℃保存或立即PCR。PCR反应体系：在0.3 ml PCR管，依次加入下列试剂：cDNA 5 μl、上游引物(10 pmol/L)1.5 μl、下游引物(10 pmol/L)1.5 μl、dNTP(2 mmol/L) 4 μl、10×PCR缓冲液5 μl Taq酶(2 U/μl)0.3 μl、ddH2O 32.7 μl，使总体积达50 μl→轻轻混匀、稍离心→设定PCR程序：94℃45 s，58℃45 s，72℃ 1 min，72℃延伸8 min，30个循环。引物：TNF-α(1 480 bp) 上游引物 5′-acagaaagcatgattccgaga-3′，下游引物 5′-tcagtagacagaagagcgtgg-3′；β-actin (570 bp) 上游引物 5′- acggcattgtcaccaactg -3′，下游引物5′- gcagctcatagctcttctc-3′。采用Tannon GIS凝胶电泳图像分析仪进行密度扫描、结果分析、计算目的基因相对表达水平。收集各组不同时期肺泡灌洗液上清，-20℃冻存，统一采用晶美的ELISA试剂盒，按照试剂盒操作说明检测TNF-α含量。

1.2.5组织标本染色 取石蜡切片，60℃烤2 h，二甲苯脱蜡，酒精梯度脱水后，常规苏木素-伊红(HE)染色、Masson三联染色。观察肺组织病理学改变。参照Szapiel〔2〕方法确定肺泡炎和肺纤维化程度。即将肺泡炎分为4级：①无肺泡炎(-) 0分；②轻度肺泡炎(+)1分：单核细胞浸润使肺泡隔增宽，仅限于局部和近胸膜部，面积小于全肺的20%，肺泡结构正常；③中度肺泡炎() 2分：受累面积占全肺的20%～50%近胸膜部较重；④重度肺泡炎() 3分：面积>50%，偶见肺泡腔内有单核细胞及出血造成的实变。肺纤维化同样进行评分：①无肺纤维化(-) 0分；②轻度肺纤维化(+) 1分：受累面积<20%；③中度肺纤维化() 2分：受累面积20%～50%；(4)重度肺纤维化() 3分：受累面积>50%，肺泡结构紊乱。

1.2.6羟脯氨酸含量测定 肺组织加0.8 ml冰冷的PBS进行研磨，然后用0.2 ml预冷的PBS冲洗玻璃研磨管，一并倒入玻璃试管中。然后用南京建成羟脯氨酸检测试剂盒(碱水解法)检测羟脯氨酸含量。羟脯氨酸含量(μg/ml)=(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)×标准管含量(5 μg/ml)×稀释倍数。

2 结 果

2.1肺组织大体形态及组织病理变化 (1)正常对照组：各时相点肺组织均呈粉红色，表面光滑均匀，无出血水肿等病理改变。肺泡炎的程度在各个时间点无明显变化。(2)博莱霉素组：肺泡炎的程度在2 w时表现最重，有明显的充血、水肿、出血点增多、部分融合成片；4 w时可见局部陈旧性出血点，肺表面不光滑，双肺体积可缩小、苍白，出现小结节，肺硬度增加；6 w时双肺体积缩小，表面布满结节，肺脏较硬，双肺周边可见致密的灰白或黄褐色纤维组织，近中央部分病变较轻，仅有轻度异常；2～6 w时炎症程度均高于对照组(均P<0.05)，8 w时双肺较6 w无明显改变。(3)博莱霉素+DcR3组：2 w时可见充血水肿、出血点；4 w时双肺颜色粉红，个别双肺周边可见白色结节；6 w时双肺较软，颜色粉红，仅在双肺周边见少量散在结节；8 w时双肺改变基本同6 w。博莱霉素+DcR3组肺泡炎的程度表现为逐渐减轻的过程，2～6 w时炎症程度均低于博莱霉素组(均P<0.05)，各时间点与对照组比较无显著性差异(P>0.05)；8 w时三组炎症严重程度无显著性差异(P>0.05)。见表1。

对照组肺纤维化程度在各个时间点无明显变化；博莱霉素组肺纤维化程度逐渐加重，各时间点与对照组比较均具有显著性差异(P<0.05)；博莱霉素+DcR3组肺纤维化程度无明显加重趋势，4～8 w时与对照组比较差异显著(P<0.05)，2～4 w肺纤维程度与博莱霉素组无明显差异(P>0.05)，6～8 w肺纤维程度与博莱霉素组比较有显著性差异(P<0.01)。见表2。

2.2不同实验组、不同时期BALF细胞计数的变化 对照组BALF细胞总数波动在6～7×106/ml；博莱霉素组高于对照组，尤其在2～4 w细胞总数差异显著(P<0.01)，6～8 w与对照组比较无显著性差异(P>0.05)；博莱霉素+DcR3组BALF细胞总数在2 w时最高，此后下降明显，到第8周时反而低于对照组(P<0.05)，其他时间点与对照组比较差异无显著性(P>0.05)，与博莱霉素组在2、4、8 w时比较均有显著性差异(均P<0.05)。见表2。

2.3肺泡灌洗液中TNF-α表达量的变化 分别收集三组2、4 w肺泡灌洗液中的细胞(4 w后灌洗液细胞相对较少，提取RNA成功率低，故取消)，RT-PCR半定量分析TNF-α mRNA的表达量，结果显示对照组细胞有微量TNF-α mRNA表达；博莱霉素组表达量明显升高，与对照组比较有显著性差异(P<0.01)；博莱霉素+DcR3组细胞有少量TNF-α mRNA表达，2 w时与对照组和博莱霉素组比较有显著性差异(P<0.01)，4 w时与博莱霉素组比较仍有显著性差异(P<0.01)，但与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。见图1。肺泡灌洗液上清中TNF-α蛋白含量的检查结果显示：对照组各时间点TNF-α仅有微量表达；博莱霉素组该细胞因子的表达在各个时间点均高于对照组(P<0.01)，TNF-α的表达水平逐渐下降，至第8周与对照组和博莱霉素+DcR3组已无统计学差异(P>0.05)，博莱霉素+DcR3组二者的表达与对照组比较无显著性差异(P>0.05)，与博莱霉素组比较有显著性差异(P<0.05)。见表3。

表1 病理切片肺泡炎程度评分结果

表2 病理切片纤维化程度评分及BALF细胞计数

图1 TNF-α RT-PCR电泳结果

2.4肺组织切片染色结果 正常对照组：光镜观察可见大鼠肺结构清晰，各观察点均未出现明显改变，Masson染色未见绿色胶原沉积。博莱霉素组：6 w时肺泡结构破坏明显，肺泡壁增厚，成纤维细胞大量增多，肺间质纤维化瘢痕形成，毛细血管腔闭塞，Masson染色可见肺泡间隔内有大量绿色胶原沉积；8 w时改变基本同6 w，Masson染色可见大量绿色胶原沉积。博莱霉素+DcR3组：6 w时无炎性细胞浸润，偶见绿色胶原沉积，较4 w无增多趋势；8 w时改变基本同6 w，可见大部分正常肺泡结构。

2.5肺组织羟脯氨酸含量测定 对照组有微量羟脯氨酸表达，各时间点含量无明显变化；博莱霉素组羟脯氨酸含量逐渐升高，6 w时达到高峰，各时间点与对照组比较有显著性差异(P<0.05)；博莱霉素+DcR3组羟脯氨酸含量在4～8 w时与对照组比较无显著性差异(P>0.05)，与博莱霉素组比较有显著性差异(P<0.05)。见表4。

表3 BALF上清中TNF-α含量的检测

表4 肺组织中羟脯氨酸含量的测定

3 讨 论

DcR3又称TR6，为1998年Pitti等〔3〕发现的一种可溶性TNF受体(TNFR)超家族成员，可与Fas、HVEM、DR3竞争结合其相应配体FasL、LIGHT及TL1A，抑制细胞凋亡，在细胞的生长、分化、死亡以及免疫调节等方面发挥重要作用，与多种疾病等密切相关。DcR3基因定位于人类第20号染色体长臂，20q13.3。DcR3 mRNA序列全长1 114 bp，含1个开放读码框，编码300个氨基酸，N末端前29个氨基酸为信号肽序列，蛋白分子量约35 000 KD。DcR3肽链含4个串联的富集半胱氨酸的重复序列，此为TNFR超家族的共同标志，但DcR3缺乏明显的跨膜结构，属于分泌性蛋白，可用于静脉注射。目前关于DcR3的研究主要集中在肿瘤、自身免疫性疾病、胰岛移植等方面〔4，5〕，在肺纤维化的研究中较少，本研究提示其可能有一定的抗炎作用〔6〕。同时Wortinger等〔7〕建立FasL诱导的急性肺损伤小鼠模型时发现，预先用DcR3类似物处理的小鼠较未经处理的小鼠中性粒细胞浸润减少，支气管肺灌洗液中的GM-CSF、MIP及KC等炎性介质显著降低。文献〔8〕也报道，局部注射可以改善风湿性关节炎的关节活动度，DcR3可以直接中和实验性自身免疫性脑脊膜炎局部的炎症和下调Th1T细胞的数目，抑制干扰素(IFN)-γ和白细胞介素(IL)-17或TNF-α表达。

大量的动物实验和临床实验发现〔9〕，肺纤维形成早期局部肺组织存在大量炎性细胞浸润，各种促炎性物质在肺组织局部聚集。参与的细胞因子和其他的介质较多，且在不同阶段所参与的细胞因子有所不同，TNF-α、IL-1、的表达高峰在炎症期，此后逐渐减弱；转化生长因子(TGF-β)1、IL-10在早期表达，在炎症期形成高峰，此后仍维持高水平表达，本研究说明DcR3的应用的确抑制了博莱霉素致肺纤维化大鼠模型的炎症反应。

通常将肺纤维化的发生过程分为两个阶段，初始的肺泡炎阶段即致病因素导致上皮损伤，上皮下基底膜破坏、炎症细胞、免疫细胞活化，分泌各种炎症因子；肺纤维化阶段：在第一阶段炎症因子的作用下，成纤维细胞募集、分化、增生，胶原和细胞基质过度增生，肺纤维化形成。早期的炎症因子TGF-β、TNF-α、IL-4、 IL-13以及 IFN-γ、IL-1β等的大量产生可激活体内一系列细胞信号传导通路，如ERK-MAPK信号通路，其在启动分子信号调节成纤维细胞增殖方面非常重要〔10，11〕。此外，JNK-、p38-以及Smad等信号转导通路均具有促进肌成纤维细胞分化的作用，这些通路均在炎症因子的刺激下活化从而促进肺纤维的发生〔12〕。 可见阻止炎症反应的扩大化，抑制某些关键细胞因子的释放理论上可以预防肺纤维化的发生。

本研究通过延长观察时间发现，早期注射DcR3组的大鼠其肺纤维化程度明显减轻，甚至局限化，大鼠一般生活状态明显恢复，这提示DcR3早期的抗炎作用可能在一定程度上预防了肺纤维化的发生，但DcR3在肺纤维的形成是否存在直接作用，尚需要进一步研究。

4 参考文献

1Zhan C，Patskovsky Y，Yan Q，etal.Decoy strategies：the structure of TL1A：DcR3 complex〔J〕.Structure，2011;19(2)：162-71.

2Szapiel SV，Elson NA，Fulmur JD，etal.Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the nude，athymic mouse〔J〕.Am Rev Respir Dis，1979;120(4)：893-7.

3Pitti RM，Marsters SA，Lawrence DA，etal.Genomic amplification of a decoy receptor for Fas ligand in lung and colon cancer〔J〕.Nature，1998;396(6712)：699-703.

4Takahashi M，Miura Y，Hayashi S，etal.DcR3-TL1A signalling inhibits cytokine-induced proliferation of rheumatoid synovial fibroblasts〔J〕.Int J Mol Med，2011;28(3)：423-7.

5Bamias G，Evangelou K，Vergou T，etal.Upregulation and nuclear localization of TNF-like cytokine 1A (TL1A) and its receptors DR3 and DcR3 in psoriatic skin lesions〔J〕.Exp Dermatol，2011;20(9)：725-31.

6郏 博，杨 洋，齐欣萌,等.诱骗受体3对肺纤维化动物模型早期的作用〔J〕.细胞与分子免疫学杂志，2010;26(6)：602-3.

7Wortinger MA，Foley JW，Larocque P，etal.Fas ligand-induced murine pulmonary inflammation is reduced by a stable decoy receptor 3 analogue〔J〕.Immunology，2003;110(2)：225-33.

8Fukuda K，Miura Y，Maeda T，etal.Decoy receptor 3 regulates the expression of various genes in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts〔J〕.Int J Mol Med，2013;32(4)：910-6.

9Eickmeier O，Boom LV，Schreiner F，etal.Transforming growth factor β1 genotypes in relation to TGF β1，interleukin-8，and tumor necrosis factor alpha in Induced sputum and blood in Cystic fibrosis〔J〕.Mediators Inflamm,2013;20(13)：913135.

10Hayashi S，Nishiyama T，Miura Y，etal.DcR3 induces cell proliferation through MAPK signaling in chondrocytes of osteoarthritis〔J〕.Osteoarthritis Cartilage，2011;19(7)：903-10.

11Cheng CP，Sytwu HK，Chang DM.Decoy receptor 3 attenuates collagen-induced arthritis by modulating T cell activation and B cell expansion〔J〕.J Rheumatol.2011;38(12)：2522-35.

12Bei Y，Hua-Huy T，Duong-Quy S，etal.Long-term treatment with fasudil improves bleomycin-induced pulmonary fibrosis and pulmonary hypertension via inhibition of Smad2/3 phosphorylation〔J〕.Pulm Pharmacol Ther,2013;26(6):635-43.