ABCE1基因沉默对人肝癌SMMC-7721细胞增殖和迁移能力的影响

白 东 张 建 张春阳

(沈阳医学院附属奉天医院普外三科，辽宁 沈阳 110024)

原发性肝癌在我国恶性肿瘤中死亡率居第二位〔1〕。虽然化疗和新辅助化疗在肝癌的治疗中已得到了广泛的应用。但是肝癌的预后仍不十分理想，尤其是已发生临床转移和肿瘤复发的患者〔2〕。近年来发现ATP 结合盒转运子E1(ABCE1)在肿瘤发生、发展中发挥着重要的作用，ABCE1的异常表达可能与恶性肿瘤的增殖、转移有关〔3，4〕。本研究探讨ABCE1基因其对肝癌细胞生物学行为的影响。

1 材料和方法

1.1主要材料 人肝癌SMMC-7721细胞购于上海研晶生物科技有限公司；DMEM培养基、Opti-MEM，G418，胰蛋白酶(GIBCO BRL,美国)、胎牛血清(FBS) (中国医学科学院血液学研究所)；脂质体转染试剂Lipofectamine2000TM (美国Invitrogen 公司)；L质粒提取试剂盒、RNA 提取试剂Trizol、DNA凝胶纯化回收试剂盒(北京天根公司)； DNA marker、T4 DNA连接酶(日本Takara 公司)；逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)两步法试剂盒(美国Promcga公司) ， cDNA合成试剂盒(日本TOYOBO公司)；AMV逆转录试剂盒(杭州博日)；RNA干扰序列(珠海英平生物技术有限公司合成)；PCR 引物序列(Invitrogen 公司化学合成)；CCK-8(上海炎彬化工公司)；兔抗人ABCE1多克隆抗体(美国Abcam公司)；HRP 标记的羊抗鼠IgG(美国Santa Cruz 公司)；鼠抗GAPDH 单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；HRP 标记的兔抗羊IgG(北京博奥森公司)；PVDF膜(美国Bio-Rad公司)；ECL化学发光试剂盒(美国Thermo公司)；Matrigel gel(美国BD公司)。

1.2方法

1.2.1siRNA设计、合成及转染 根据参考文献〔5〕设计靶向人类ABCE1 siRNA序列，正义链为：5'-ATCCGCTACAGCGAGTACGTTTACCTGTGAAGCCACAGATGGGGTAAACGTACTCGCT-TAGCTTTTTTG - 3'；反义链为：5'-AATFCAAAAAAGCTACAGCGAGTACGTTTACCCCATCTGTGGCTTCACAGGTAAACGT-ACTCGCTGTAGCG-3'。阴性对照siRNA正义链为：5'-GATCCGCGAGACCTCAGTATGTTACCTGTGAAGCCACAGATGGGGTA-ACATACTGAGGTCTCGCTTTTTTG-3'；反义链为：5'AATTCAAAAAAGCGAGACCTCAGTATGTTACCCATCTGTGGCTTCA-CAGGTAACATACTGAGGTCTCGCG-3'。 均由珠海英平生物技术有限公司合成，肝癌细胞株SMMC-7721细胞培养于含10%小牛血清的DMEM培养基中，置于37℃ 5%CO2密闭式孵箱内培养，传代。 实验时取对数生长期的细胞。按2 × 105个/孔将肝癌细胞株SMMC-7721接种于6孔板中，当融合率达80%时以脂质体法进行转染。转染时分为三组：转染pGenesil-1-ABCE1-siRNA载体者为SMMC-7721/ABCE1-siRNA组(实验组)，转染NC siRNA载体者为SMMC-7721/control组(对照组)，未转染的肝癌SMMC-7721为SMMC-7721组(空白组)。于转染后48 h进行 RNA 干扰效应的检测。

1.2.2RT-PCR检测 细胞弃培养液后磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，通过TRIzol法提取总RNA，用cDNA合成试剂盒反转录合成cDNA。分别扩增ABCE1和内参GAPDH。ABCE1引物序列: 上游：5'- TTGGTTGTGGGAAGTCGT-3，下游：5'-GCTTATGTAGTTAATGGGAGGT-3'，扩增产物为415 bp。GAPDH上游：5'-GAGTCAACGGATTGGTCGT-3'，下游：5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'，扩增产物为185 bp。PCR反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环。PCR产物采用2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外灯下观察电泳结果，UVI 凝胶成像系统摄像，Image-Pro Plus 7.0 软件分析条带灰度值，用ABCE1/GAPDH 代表ABCE1 mRNA的相对表达量。

1.2.3Westem 印迹检测 每组收集1×107个细胞，PBS冲洗3次，提取总蛋白，通过BCA法测定蛋白质浓度，吸取50 μg总蛋白，去离子水补至20 μl，入等体积2×上样缓冲液，99℃ 变性10 min。离心后吸取30 μl 上样，经10%SDS-PAGE 分离后，用半干法电转移至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉，37℃封闭,2 h，加入1∶1 000稀释的ABCE1多克隆一抗，4℃过夜，TBST 洗膜5次，每次5 min，加入1∶5 000 HRP标记的二抗和GAPDH,于37℃孵育2 h。PBS洗涤，采用ECL法检测。暗室曝光X光片，冲洗胶片，UVI 凝胶成像系统摄像Image-Pro Plus 7.0软件分析条带灰度值，用ABCE1/GAPDH代表代表ABCE1的相对表达量。

1.2.4流式细胞仪检测细胞周期 收集三组细胞，调整细胞浓度为1×106/L，以冷PBS缓冲液洗涤2次,细胞沉淀用70 %的冷乙醇(4℃) 混匀备用，洗涤细胞，后再用PBS调细胞浓度为1×106/L与含50 μg/ml RNA 酶的Tris-HCL缓冲液(pH7.4)共同孵育30 min。100 μg/ml (1 μg/ml)碘化丙啶(PI)进行细胞的DNA 染色，暗室中放置1 h 后通过流式细胞仪分析细胞的DNA含量分布，并计算出各个周期细胞所占的百分率。

1.2.5CCK8法检测细胞增殖 指数生长期细胞接种于96孔板，调整细胞密度每孔达到1×103，加入含10%胎牛血清DMEM培养基200 μl，每组设6个复孔，培养24 h后，每孔加入CCK-820 μl，培养箱温育4 h后，以不加细胞空白孔为对照，用酶标仪检测490 nm处吸光度A值。以细胞吸光度A值平均值为纵坐标，以时间48、72、96及120 h为横坐标绘制生长曲线。

1.2.6细胞划痕损伤实验 在对数生长期将上述3种细胞分别以5×103个/孔的密度接种于6孔板，待培养的各组细胞生长形成细胞单层后，用10 μl移液枪头或无菌牙签在单层细胞上呈“一”字划痕。PBS轻柔洗涤，每孔加入2 ml不含血清的DNEM培养液继续培养，于48 h后倒置显微镜100倍下观察细胞迁移情况。

1.2.7TransweⅡ小室侵袭实验 在聚碳酸酯微孔滤膜上铺Matrigel 50 μg/孔，在聚合好的小室下室加入10%的胎牛血清做条件培养液，在上室加入按上述3种细胞处理过的SMMC-7721细胞悬液100 μl(细胞总数为3×105/L)，置于培养箱中24 h后取出，以棉签小心刮除滤膜上室面未穿过的瘤细胞，95%的乙醇固定5 min，PBS轻轻漂洗三遍，苏木精染色10 min，PBS缓冲液冲洗小室，自然晾干，将上室的聚碳酸酯滤膜沿边缘用手术刀片小心取下，用树脂胶固定于玻片上(膜内面朝上)，封片；干燥后在200×光镜下每膜计数上、下、左、右、中5个视野的侵袭细胞数，计算平均值。每组平行设3个小室，重复3次。

2 结 果

2.1siRNA抑制ABCE1 mRNA的表达 ABCE1 mRNA表达的RT-PCR检测显示：与对照组和空白组比较(0.70±0.05,0.69±0.07)，实验组条带明显变窄(0.36±0.04,P<0.05)。见图1。

2.2siRNA抑制ABCE1蛋白的表达 ABCE1蛋白表达的Western 印迹检测显示：与对照组和空白组比较(0.84±0.05,0.85±0.07)，实验组条带明显变窄(0.66±0.04,P<0.05)。见图2。

2.3细胞周期检测 流式细胞仪检测细胞周期结果显示，G0/G1期，实验组较对照组和空白组略有增加，S期略有减少(P<0.05)。M期细胞无明显变化(P>0.05)。说明有明显的S期阻滞。见表1。

2.4siRNA对细胞增殖的影响 依CCK-8法检测结果绘制的生长曲线示实验组较对照组和空白组曲线明显降低(P<0.05)。见图3。

图1 RT-PCR检测SMMC-7721细胞中ABCE1 mRNA的表达

图2 Western 印迹检测SMMC-7721细胞中ABCE1蛋白的表达

表1 siRNA抑制ABCE1表达对SMMC-7721细胞周期的影响±s，n=3，%)

图3 ABCE1 siRNA对SMMC-7721细胞生长的影响

2.5细胞划痕损伤实验结果 48 h后实验组细胞划痕愈合缓慢，而M对照组和空白组细胞划痕已基本长满，说明实验组迁移能力显著下降。见图4。

2.6SMMC-7721细胞体外侵袭力的变化 对照组和空白组穿过滤膜的细胞数量较多分别为(78.64±4.83)和(77.90±4.38)，实验组穿膜细胞数为(46.42±3.61)，差异有统计学意义(P<0.05)。表明特异性干扰ABCE1基因表达可能有效降低SMMC-7721细胞的侵袭力。见图5。

图4 细胞划痕损伤实验结果

图5 小室侵袭实验结果

3 讨 论

肿瘤的发生是一个多阶段逐步演变的过程，细胞通过一系列进行性的改变而向恶性发展〔6〕。这期间涉及许多基因的改变，其中既有原癌基因的激活和高表达的发生，也有抑癌基因和凋亡基因的失活，还涉及大量细胞周期调节基因功能的改变〔7～9〕。许多研究显示在肿瘤演变向恶性发展过程中存在一种调控分子在控制这些基因的表达变化，进而影响肿瘤的发生发展。相关研究提示ABCEI基因就是这么一种新的“调控分子”，参与了肿瘤的形成和发展。

ABCEI基因定位于常染色体4q31上，是ATP结合盒转运子亚家族的成员之一，具有高度的保守性，编码一种名为核糖核酸酶L(RNase L)抑制因子的68 kD蛋白〔10〕。该蛋白能够阻断干扰素介导的细胞抗病毒2-5A/RNase L通路，抑制细胞凋亡过程，并可在促进蛋白质合成及细胞增殖分化方面发挥作用〔11〕。有研究〔12〕表明，在肿瘤细胞系中抑制ABCE1的表达可明显阻碍肿瘤细胞的生长。提示ABCE1的表达与肿瘤细胞的发生、发展密切相关，理论上阻断肿瘤细胞中ABCE1的表达可起到治疗肿瘤的作用。

越来越多的证据表明，ABCE1与癌细胞生长调控和迁移侵袭密切相关。本研究用使用RNA 干扰技术抑制肝癌SMMC-7721细胞ABCE1基因的表达后，细胞的生长速度明显减慢，迁移能力显著下降，ABCE1基因沉默后S期细胞数明显减少，细胞被阻滞在G0/G1期。同时划痕试验和小室侵袭实验表明ABCE1基因沉默后肝癌SMMC-7721细胞的迁移能力和侵袭能力降低。与赵艾君等〔13〕对肺癌95-D/NCI-H446细胞的研究结果相同。

总之，ABCE1基因不仅与肿瘤细胞的迁移能力和侵袭能力变密切相关，而且在促进肿瘤细胞增殖方面起着重要作用〔14〕。特异性干扰ABCE1基因表达可抑制肝癌SMMC-7721细胞的迁移能力，并抑制肿瘤细胞增殖，因此，ABCE1的siRNA序列可能成为治疗肝癌的有效靶点。干预ABCE1可能会为肝癌等恶性肿瘤的治疗提供新的思路。

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