黄芪注射液对实验性脑出血大鼠神经功能的影响

夏明武 秦 勇 许 浩 胡光民

(合肥市第二人民医院神经内科，安徽 合肥 230038)

我国自发性脑出血(ICH)患者占全部脑卒中患者的30%左右，急性期病死率约为30%～40%。中药黄芪是常用的益气活血药，近年来被用于脑出血的治疗，有一定效果，但其具体的作用机制尚不明确。本研究观察黄芪注射液对脑出血大鼠神经功能的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 健康雄性SD大鼠48只，体重250～300 g，由安徽医科大学实验动物中心提供(编号0001956)。

1.2药物与试剂 黄芪注射液：正大青春宝业有限公司，国药准字Z33020179 10 ml/支；CD34抗体：购自Santa Cruz Biotechnology公司，产品编号 sc-7324；兔抗微管相关蛋白2(MAP-2)多克隆抗体：购自美国Sigma-Aldrich公司，产品编号M3696；SABC免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒：购自武汉博士德生物试剂公司。

1.3方法

1.3.1动物的处理及取材 48只SD大鼠随机分为模型组和黄芪治疗组，每组24只。术后1 h开始给药，黄芪治疗组于造模后1 h开始腹腔注射黄芪注射液(10 ml/kg-1/d-1)。模型组给予等量的生理盐水腹腔注射，均为连续7 d。术后第7天和第14天在两组中分别取12只大鼠进行神经行为学评分，然后10%的水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，腹主动脉取血2 ml，入抗凝管，立即送安徽医科大学，流式细胞仪检测外周血CD34+细胞的含量；经左心室至主动脉4%多聚甲醛溶液(4℃)灌注取脑，脱水，石蜡包埋。

1.3.2大鼠分组及脑出血模型的制备 参考大鼠脑立体定位图谱以Yang等〔1〕方法造模，10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射，将大鼠麻醉固定在立体定位仪上，在前囟前0.2 mm，矢状缝向右旁开3.0 mm，处颅骨钻孔。取0.1 ml尾动脉血，以颅骨外板高度为零点将头皮针刺入脑内，进针深度为6 mm。将75 μl自体不凝血(肝素抗凝)缓慢注入基底节区，留针10 min后缓慢拔针，手术部位消毒后缝合皮肤，放回笼中喂养。术后根据Berderson等〔2〕评分标准：无神经功能缺损0分；注射对侧前爪不能伸直1分；出现转圈现象2分；行走时身体向对侧倾倒3分；无反应，完全不能行走4分。神经症状1～3分为造模成功。

1.3.3神经行为学评价 通过触须诱发大鼠前肢放置实验测试神经行为学，每只大鼠每个前肢重复刺激10次，记录触须刺激后前肢放置于工作台面的次数所占百分数。

1.3.4免疫组织化学染色 脑组织石蜡切片，常规脱蜡至水，采用SABC法行MAP-2免疫组化染色，检测免疫阳性细胞，严格按照试剂盒说明书操作。用Image-Pro Plus 5.0进行图像分析，400倍镜下视野测量MAP-2表达的平均光密度值(MOD)。每例标本取4张片子，每张片子出血区周围随机取5个视野，取平均值。所用MOD值采集均在相同光学和光镜条件。

2 结 果

2.1神经功能评分 在前肢放置实验中，黄芪治疗组在第7天及第14天的神经功能评分(0.398±0.071，0.638±0.023)明显高于同时间点模型组的评分(0.168±0.066,0.326±0.047)(P<0.05)，且同组中第14天的神经功能评分高于第7天时的评分(P<0.05)，表明脑出血大鼠经用黄芪治疗后可以促进神经功能的恢复，并随着时间的推移，恢复效果也明显。

2.2外周血CD34+细胞含量的比较 用CD34+细胞占动脉血有核细胞百分比表示。黄芪治疗组第7、14天外周血CD34+细胞含量(0.199±0.112)、(0.153±0.038)〕明显高于同时间点的模型组〔(0.074±0.028)、(0.030±0.057)%〕(P<0.05)，同组中第14天的外周血 CD34+细胞含量低于第7天时的含量(P<0.05)，表明黄芪对内源性骨髓干细胞有动员作用，动员作用随着时间的推移而下降。

2.3MAP-2蛋白表达比较 黄芪治疗组第7、14天的MAP-2蛋白表达水平(0.193±0.038、0.240±0.112)高于同时间点模型组(0.080±0.017、0.124±0.028)(P<0.05)，同组中第14天的MAP-2蛋白表达水平高于第7天的表达水平(P<0.05)。表明脑出血大鼠经用黄芪治疗后可以促进血肿周围MAP-2蛋白的表达，且随着时间的推移脑出血血肿中心MAP-2蛋白表达水平增高。图1。

术后7 d模型组 术后7 d黄芪治疗组 术后14 d模型组 术后14 d黄芪治疗组

3 讨 论

自发性脑出血可导致神经元的急性损伤和坏死，从而导致不同程度的神经功能障碍。近年来内源性干细胞的动员成为重塑受损神经网络的重要途径之一，骨髓中含有骨髓造血干细胞和骨髓间质干细胞两大类干细胞，骨髓造血干细胞主要分化成各种血细胞；骨髓间质干细胞能产生表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经生长因子、脑源性神经营养因子及血管内皮生长因子等，具有转化成神经细胞的能力〔3〕。Mezey等〔4，5〕研究认为，骨髓间质干细胞能够迁移到受损的脑组织区域并分化成不同的脑组织细胞，以修复受损脑组织，从而起到神经修复和功能康复作用。

来源于骨髓造血干/祖细胞的CD34抗原具有黏附、加速血管前内皮细胞聚集形成血管的功能，CD34抗原的表达随着细胞的成熟会逐渐逐渐减弱至消失〔6〕。所以，外周血CD34+细胞数可以间接评价外周血干细胞含量，同时CD34+细胞也是内皮前体细胞的来源，CD34+细胞的水平可以反映血管内皮功能变化，CD34抗原可作为检测新生血管的标志性抗原。本文说明黄芪可以骨髓干细胞入血。CD34+细胞在体内能迁移到缺血部位参与新生血管形成及血管内皮的修复，改善微循环，促进血流恢复和神经再生〔3〕。

微管相关蛋白2(MAP-2)主要表达在神经元胞体内微管及树突上〔7〕，参与神经元的生长和损伤后修复过程〔8〕，被认为是 研究神经再塑的分子标志物。本研究结果显示，模型组血肿周边只有少量MAP-2表达，而黄芪治疗组血肿周边MAP-2表达增强，表明通过黄芪的治疗作用血肿周边的神经轴突和树突增生相对活跃，出现了神经细胞的修复和再生。

脑出血造成的病理性损伤主要包括出血对脑实质的机械性破坏，继发脑缺血、脑水肿、炎症及细胞凋亡等〔9〕。黄芪注射液对脑出血的神经功能保护作用的机制可能是：①抑制炎性细胞分泌〔10〕，减轻脑水肿，起到神经保护的作用。②减少脑出血灶早期神经元细胞内细胞色素C的释放及提高Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-Mg2+-ATP 酶的活性，从而减轻脑出血灶区神经细胞的凋亡〔11〕。③扩张血管、降低周围血管阻力，改善微循环〔12〕；降低血脑屏障的通透性〔10〕，减轻脑水肿。④抑制脑出血急性期星形胶质细胞的过度活化和GFAP的过度表达，从而有利于脑出血损伤后神经功能的恢复〔9〕。

本实验发现，黄芪注射液可以明显改善脑出血大鼠的神经功能，其作用机制可能是动员足量的骨髓间质干细胞迁移至脑出血区及周边，促进新生血管形成及血管内皮的修复血管，促进神经的再生修复和神经功能的恢复。

4 参考文献

1Yang GY， Bets AL，Chenevert TL，etal.Experimental intracerebral hemorrhage：relationship between brain edema，blood flow,and blood-brain barrier permeability in rats〔J〕.Neurosurg，1994；81(1)：93-102.

2Bederson JB，Pitts LH，Tiles M,etal.Rat middle cerebral artery occlusion：evaluation of the model and development of a neurologic examination 〔J〕.Stroke，1986；17(6)：472-6.

3何晓英，袁 平，谭 华，等.重组人粒细胞集落刺激因子对脑出血大鼠脑水肿及血管再生的影响 〔J〕.中国组织工程研究与临床康复,2009；13(19):3661-4.

4Mezey E，Key S，Vogelsang G，etal.Transplanted bone marrow generates new neurons in human brains〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2003； 100(3)：1364-9.

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6Shi Q，Rafii S，Wu MH,etal.Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells〔J〕.Blood，1998;92(2):362-7.

7Matus A.Microtubule-associated proteins：their potential role in determining neuronal morphology〔J〕. Annu Rev Neurosci，1988；11(1)：29-44.

8吴 旭，杨 丽，王保捷，等.MAP-2 在大鼠脑损伤后表达变化的时间规律性研究〔J〕.中国法医学杂志,2011；26(4):269-72.

9Mutlu N，Berry RG，Alpers BJ.Massive cerebral hemorrhage:clinical and pathological correlations〔J〕.Arch Neurol，1963；8(10):644-61.

10范崇桂，王桂敏.黄芪改善脑出血大鼠血脑屏障损伤及TNF-α机制的研究.〔J〕.中西医结合心脑血管病杂志,2008；6(11):1312-3.

11孙 征，王登科，张海宇，等.黄芪注射液对早期大鼠脑出血灶周围神经元CytC和线粒体ATPase 的影响〔J〕.宁夏医科大学学报，2011;33(5):407-10.

12吴发宝，陈希元.黄芪药理作用研究综述〔J〕.中药材,2004； 27(3)：232-4.