斜链拟青霉菌丝体粗提物体内外抗氧化作用

杨 成 陈名君 董 群

(皖南医学院微生物学与免疫学教研室，安徽 芜湖 241002)

自由基清除剂可直接或间接清除体内过多的自由基，有效阻止或防止由于过多自由基而导致的氧化损伤，起到保护机体延缓衰老的作用〔1〕。因此，开放与研究抗氧化剂具有重要的意义。而有关虫生真菌抗氧化活性的报道多集中在体外实验研究〔2～5〕，本实验采用体外与体内相结合的方法对其拟青霉属中的斜链拟青霉菌丝体粗提物进行抗氧化实验。

1 材料与方法

1.1试剂、药品、菌株 斜链拟青霉由安徽农业大学微生物防治省重点实验室提供。蛋白胨10 g/L，葡萄糖40 g/L，酵母浸出粉10 g/L，蒸馏水1 000 ml。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)(购自Sigma公司)，D-半乳糖(购自博美生物公司)，考马斯亮蓝(购自博美生物公司)，超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)，其他均为国产分析纯。

1.2实验动物 昆明系小鼠18～22 g，雌雄各半，由南京医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(苏)2007-0001。

1.3方法

1.3.1斜链拟青霉菌丝体粗提物制备 采用上述SDAY液体培养基，以10%的接种量接入一级液体种子，置28 ℃ 真菌培养箱静置培养25 d后洗涤抽滤，取洗涤后菌丝体65℃烘箱中烘干称重，以甲醇为提取溶剂，按质量与提取剂体积之比1∶30(w/v)，超声波提取4 h后离心收集上清，滤液旋转蒸发仪45℃真空浓缩至干备用。

1.3.2斜链拟青霉菌丝体粗提物体外抗氧化实验 参照文献〔4，5〕方法，甲醇溶解样品制成不同浓度1、2、4、8、16 mg/ml，取各浓度样品100 μl和预先用95%乙醇配制的0.4 mg/ml的DPPH自由基100 μl于96孔酶标板中，每个样品重复3次。将加完后将酶标板置酶标仪中振动30 s，37℃波长517 nm测定其吸光值(Ap)，37℃保温10 min再测定1次，同时测定不加DPPH自由基的样品空白吸光值(Ac)和加DPPH自由基以甲醇代替样品的吸光值(Amax)。计算相对自由基清除率。

1.3.3体内抗氧化实验动物分组与处理 参照文献〔6～8〕方法，取昆明系小鼠35只，随机分为5组，设正常组，模型组，药物高、中、低剂量组，除正常组皮下注射生理盐水外，其余4组125 mg·kg-1·d-1皮下注射D-半乳糖造模，同时对药物组进行灌胃给药治疗，高、中、低剂量组给予900、300、100 mg/kg，正常组和模型组给予等量蒸馏水，连续6 w。按常规眼球取血，加肝素抗凝后2 500 r/min 离心 10 min，取上清冷藏备用；断颈处死，取出肝组织用冰生理盐水洗涤去除血液，滤纸吸干，按肝组织重量/冰生理盐水量比为1∶10的量制备肝组织匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清冷藏备用。

1.3.4小鼠血浆中SOD活力与肝组织中MDA含量的测定 取上述1.4中获得的血浆和肝组织匀浆，分别按SOD活力试剂盒和MDA试剂盒测定其含量，操作步骤严格按试剂盒说明书进行，根据标准曲线计算含量。

1.5统计学方法 采用SPSS13.0软件进行F检验。

2 结 果

2.1斜链拟青霉菌丝体粗提物体外对DPPH自由基的清除活性 斜链拟青霉菌丝体粗提物具有清除DPPH自由基活性，且不同时间和各浓度对DPPH自由基的清除能力不同，清除活性随样品浓度的递大而增强，终反应10 min时样品对0.4 mg/ml的DPPH自由基相对清除率IC50为1.81 mg/ml。见表1。

表1 粗提物对DPPH自由基的相对清除率(%)

2.2斜链拟青霉菌丝体粗提物对小鼠血浆SOD活性和肝组织中MDA含量的影响 表2可见，对与SOD活性，高剂量组、中剂量组与模型组比较，粗提物能明显提高小鼠血清中SOD活性(P<0.05)。但给药组与正常组比较差异不显著(P>0.05)；对于MDA含量，模型组与正常组相比差异明显(P<0.05)，高剂量组与正常组、模型组比较差异显著(P<0.01)，而中剂量组、低剂量组与模型组比较，能明显的降低MDA(P<0.01)，增强机体对抗氧化损伤的能力。

表2 粗提物对衰老小鼠SOD活性和MDA含量的影响±s，n=7)

3 讨 论

衰老的自由基学说认为自由基攻击生物膜中不饱和脂肪酸发生过氧化作用，从而破坏细胞完整的膜结构，导致细胞死亡。实验采用DPPH抗氧化活性体外评价体系对斜链拟青霉菌丝体粗提物体外清除自由基活性进行评价，同时利用给小鼠连续皮下注射大剂量D-半乳糖，造成其糖代谢紊乱，进而被半乳糖氧化酶氧化产生超氧阴离子等氧自由基，攻击膜磷脂中的不饱和脂肪酸。而MDA就是脂质过氧化的终产物，也使细胞膜蛋白发生交联，进一步加剧细胞结构损害。除此之外，自由基还可以攻击细胞中DNA和其他生物大分子而导致其损伤，引起机体衰老、癌症等疾病。另一方面，机体内的SOD具有清除自由基作用，提高机体抗氧化酶活性，可以抑制或清除机体内过多的自由基，维持机体内氧化与抗氧化之间的平衡起，因此，检测这两项指标可以从一个侧面反映了药物在体内的抗氧化效果〔9〕。由实验结果可知，斜链拟青霉菌丝体粗提物在体外对DPPH自由基具有很强的清除作用；在体内，对于D-半乳糖所致的小鼠亚急性衰老模型，斜链拟青霉菌丝体粗提物既能提高其血浆中SOD活性，又降低肝组织中MDA含量，因而，显示出较好的抗氧化活性。

4 参考文献

1修晓娜，史远刚，关伟军，等.自由基与人类衰老〔J〕.中华现代中医药学杂志，2008；4(2)：108-12.

2李春如，宗文明，杨 成，等.细脚拟青霉不同菌株清除DPPH自由基活性研究〔J〕.生物学杂志，2006；23(2)：28-31.

3杨 成，胡丰林，倪 健，等.细脚拟青霉代谢产物清除自由基和抑制单胺氧化酶活性的研究〔J〕.菌物学报，2006；25(1)：63-9.

4陈安徽，李春如，樊美珍. 蝉拟青霉代谢产物清除DPPH自由基和抗真菌活性的研究〔J〕.菌物学报，2008；27(3)： 405-12.

5Hu FL，Karen S，Stefka S,etal.Radical Scavengers from the Entomogenous Deuteromycete Beauveria amorpha〔J〕.Planta Med，2002；68:64-6.

6巩睿智，陈 丽，魏 涛，等. 阿司匹林对衰老模型大鼠学习记忆能力的影响〔J〕.西安交通大学学报(医学版)，2011；32(2)：184-6.

7Jun-Jian Cui，Jiang-Feng Yuan，Zhi-Qi Zhang.Anti-oxidation activity of the crude polysaccharides isolated from Polygonum Cillinerve (Nakai) Ohwi in immunosuppressed mice〔J〕.J Ethnopharmacology，2010；132：512-7.

8徐大量，林 辉，李盛青，等.玉竹水提液体内外抗氧化的实验研究〔J〕.中药材，2008；31(5)：729-31.

9陈 瑷，周 玫.自由基与衰老〔M〕.北京：人民卫生出版社，2004：153-71.