消旋卡多曲对老年大鼠脑内淀粉样蛋白水平的影响

张健昌 黄家园 黄 河 周嘉雯 暴 珑 谢 敏 朱 铭 张艳翎 黎 黎 吴科锋 李文德 黄 韧

(广东医学院第一临床学院，广东 湛江 524023)

消旋卡多曲可用于成人、老人及儿童急性腹泻的治疗〔1～3〕，其在体内迅速代谢为活性物质硫芬(TP),TP通过抑制脑啡肽酶(NEP)活性，保护内源性脑啡肽免受机体降解，延长消化道内源性脑啡肽的生理活性，进而抑制水和电解质的过度分泌来发挥其抗腹泻作用〔4〕。TP可导致NEP活性降低，引起皮质和脑脊液中的β-淀粉样蛋白(Aβ)增多〔5～7〕，甚至可在海马及其他大脑区域出现β-淀粉样斑块的沉积〔8～11〕。现有理论认为Aβ是导致阿尔茨海默病(AD)发病的始动因素，Aβ更是AD的主要病理特征〔12〕。本研究探讨消旋卡多曲对老年SD大鼠淀粉样蛋白水平的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物和试剂 SPF级SD大鼠30只，雌雄各半，10月龄(由广东医学院实验动物中心提供，合格证号：2009A034)，体重250 g±35 g。消旋卡多曲(山东铂源化学有限公司)；鼠原性Aβ1～40、Aβ1～42、NEP ELISA试剂盒(美国RD公司)；Jk-6生物组织摊烤片机，JB-P5生物组织包埋机，生物组织脱水机(武汉俊杰电子有限公司)；转轮切片机(德国莱卡有限公司)；尼康生物显微镜(日本尼康股份有限公司)。其余试剂均为分析纯。

1.2消旋卡多曲供试液制备 消旋卡多曲100 g，置烧杯中，适量聚乙二醇400(PEG400)溶解，加蒸馏水配成含20% PEG 400的消旋卡多曲混悬液，标示量为100 mg/ml母液，置4℃冰箱备用。

1.3实验分组和处理 30只SD大鼠，随机分为空白对照组、消旋卡多曲高剂量组(50 mg/kg)、消旋卡多曲低剂量组(100 mg/kg)每组10只。消旋卡多曲各剂量组，1次/d，灌胃给予相应量的消旋卡多曲混悬液。空白对照组，1次/d，灌胃给予等量的20% PEG400溶液。28 d后，采血，置抗凝管，3 000 r/min，离心10 min，分离血浆。处死大鼠，快速取脑组织，左半球中性甲醛固定，右半球-80℃保存备用。

1.4ELISA法测定大脑及外周血中NEP及Aβ水平 取分离好的血浆及脑组织，按试剂盒说明书，加入相应量的标准品及待测品各50 μl于反应孔，并加入50 μl的生物素标记的抗体。依次每孔加入60 μl的亲和链霉素-HRP，底物A、B各50 μl。酶标仪波长450 nm处测定各孔OD值。

1.5病理观察海马神经元病理改变 取目标组织修块,置于包埋塑料盒,自来水冲洗24 h，后脱水、透明、浸蜡、包埋、修块、切片，进行HE染色，置于40倍光镜下观察神经元数目的改变、萎缩的情况，选相同的病变部位(海马区CA3及齿状回)连续照相。

2 结 果

2.1消旋卡多曲对血浆中Aβ1～40、Aβ1～42、NEP含量的影响 外周血中，消旋卡多曲各剂量组与空白对照组相比，Aβ1～40和Aβ1～42含量尽管稍有增加，但差异无显著性(P>0.05)；亦无明显降低NEP含量的迹象(P>0.05)，见表1。

表1 消旋卡多曲对大鼠血浆中Aβ1～40、Aβ1～42、NEP含量的影响(n=10，OD，±s)

2.2消旋卡多曲对脑组织中Aβ1～40、Aβ1～42、NEP含量的影响 与空白对照组相比，消旋卡多曲各剂量组均能明显增加脑组织中Aβ1～40及Aβ1～42含量(P<0.05)，但组间差异不明显，也有降低脑内NEP含量的迹象，但仅高剂量组差异显著(P<0.05)。见表2。

表2 消旋卡多曲对大鼠脑组织中Aβ1～40、Aβ1～42、NEP含量的影响(n=10，OD，±s)

2.3消旋卡多曲对大鼠脑中海马组织的CA3区和齿状回区的损伤情况 图1可见，大鼠海马CA3区，消旋卡多曲各组较空白对照组，镜下可见明显的神经细胞胞体固缩，胞核深染，核仁不明显，且高剂量组有明显的神经元萎缩。在海马齿状回区域可发现消旋卡多曲各组均出现局部颗粒细胞深染，核仁核膜分界不清的情况，神经元细胞萎缩明显，且高剂量组有明显可见的神经元细胞数量减少(见图2)。

3 讨 论

消旋卡多曲有研究〔13〕指出往人体内静脉输注156 μg Acetorphan(与Racecadotril属同一药物)〔14〕后，显示脑脊液内的NEP活性下降大约65%。NEP在中枢神经系统具有重要的生理功能，尤其在清除脑内Aβ过程中起着重要作用，是Aβ降解的主要限速酶〔8，11〕，表明脑啡肽酶活性即使是部分降低也可以使Aβ升高乃至沉积，最终导致AD的发生。

本实验这说明消旋卡多曲引起了实验对象大脑内Aβ水平升高，与相关研究小组在其他实验动物和本课题组在恒河猴脑内直接注入Thiophan能够引起皮层及基底核的神经元内淀粉样蛋白增多以及海马等部位神经元损伤的结果相一致〔15，16〕。此外，病理检查提示超量应用消旋卡多曲可促使大脑Aβ表达水平增高，对神经元造成损伤，海马区尤甚，有增加AD发病风险的可能。

文献〔17，18〕调研发现，欧洲3～89岁的腹泻患者口服消旋卡多曲发生的不良反应以消化系统疾病为主，占68.82%，主要表现为便秘、呕吐、腹胀、肝损害等，其中便秘发生率最高，神经系统的不良反应仅占10.22%，表现仅为头晕、头痛等症状，未见其他严重不良反应，但绝大部分动物实验结果显示静注或直接脑内给药，均导致β样淀粉蛋白沉积及发生不同程度的神经元细胞萎缩。消旋卡多曲在国内仅批准为用于儿童急性腹泻，对于成人尤其是老年人的使用并无明令禁止。尽管尚无相关临床资料指出消旋卡多曲能明显增加AD发生的风险，但结合本实验及过往动物实验研究的结果，该药在老年人(尤其是AD患者)仍应慎用，应注意控制用药剂量及时间。

4 参考文献

1Wang HH,Shieh MJ，Liao KF.A blind，randomized comparison of racecadotril and loperamide for stopping acute diarrhea in adults〔J〕.World J Gastroenterol，2005；11(10):1540-3.

2Alam NH，Ashraf H,Khan WA,etal.，Efficacy and tolerability of racecadotril in the treatment of cholera in adults：a double blind，randomised，controlled clinical trial〔J〕.Gut，2003；52(10):1419-23.

3Salazar-Lindo E,Santisteban-Ponce J,Chea-Woo E,etal.Racecadotril in the treatment of acute watery diarrhea in children〔J〕.N Engl J Med，2000；343(7):463-7.

4吴学军，邹 定，何笑荣.脑啡肽酶抑制剂消旋卡多曲的药理及临床评价〔J〕.中国新药杂志，2006；15(24)：2170-2.

5De Bruyn G.Diarrhea in adults (acute)〔J〕.Am Fam Physician,2008；78(4):503-4.

6Newell AJ,Sue LI,Scott S,etal.Thiorphan-induced neprilysin inhibition raises amyloid beta levels in rabbit cortex and cerebrospinal fluid〔J〕.Neurosci Lett，2003；350(3):178-80.

7Hauss-Wegrzyniak B,Wenk GL.Beta-amyloid deposition in the brains of rats chronically infused with thiorphan or lipopolysaccharide：the role of ascorbic acid in the vehicle〔J〕.Neurosci Lett，2002；322(2):75-8.

8Iwata N,Tsubuki S,Takaki Y,etal.Identification of the major Abeta1-42-degrading catabolic pathway in brain parenchyma：suppression leads to biochemical and pathological deposition〔J〕.Nat Med，2000；6(2):143-50.

9Shalova IN,Cechalova K,Rehakova Z,etal.Decrease of dehydrogenase activity of cerebral glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in different animal models of Alzheimer′s disease〔J〕.Biochim Biophys Acta,2007；1770(5):826-32.

10Dolev I,Michaelson DM.A nontransgenic mouse model shows inducible amyloid-beta (Abeta) peptide deposition and elucidates the role of apolipoprotein E in the amyloid cascade〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2004；101(38):13909-14.

11Mazur-Kolecka，Frackowiak BJ.Neprilysin protects human neuronal progenitor cells against impaired development caused by amyloid-beta peptide〔J〕.Brain Res,2006；1124(1):10-8.

12Hardy J，Selkoe DJ.The amyloid hypothesis of Alzheimer′s disease：progress and problems on the road to therapeutics〔J〕.Science，2002；297(5580):353-6.

13Spillantini MG，Geppetti P，Fanciullacci M,etal.In vivo′ enkephalinase′ inhibition by acetorphan in human plasma and CSF〔J〕.Eur J Pharmacol，1986；25(1):147-50.

14Hamza H，Ben Khalifa H，Baumer P,etal.Racecadotril versus placebo in the treatment of acute diarrhoea in adults〔J〕.Aliment Pharmacol Ther，1999；13(6):15-9.

15李文德，吴玉娥，闵凡贵，等.颅内注射淀粉样beta蛋白片段1-42和thiorphan对恒河猴脑内淀粉样蛋白表达的影响〔J〕.中国药理学与毒理学杂志，2010；24(2):89-95.

16Li WD,Wu YE，Min FG，etal.A nonhuman primate model of Alzheimer′s disease generated by intracranial injection of amyloid-beta42 and thiorphan〔J〕.Metab Brain Dis，25(3):277-84.

17钟月平.消旋卡多曲临床应用情况的调查〔J〕.中国实用医学，2010；5(2):146-7.

18张健昌,周嘉雯,李文德.消旋卡多曲致不良反应的文献分析〔J〕.广东医学院学报,2011；29(6):672-3.