敲低hnRNP H基因对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖和细胞周期的影响及意义

赵向寨 卢庆玲 郭 影 王 璟

(河北医科大学第三医院，河北 石家庄 050010)

子宫内膜癌是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤，是女性生殖道三大恶性肿瘤之一〔1〕。核不均一核糖体蛋白H(hnRNP H)是hnRNPs家族成员。hnRNPs家族参与mRNA转运、代谢、剪切、表达等体内多种调节过程〔2〕。肺癌、胰腺癌、妊娠滋养细胞肿瘤〔3～6〕等多种肿瘤研究相关报道提示，hnRNP A2/B1、hnRNP H和hnRNP K与肿瘤转移正相关。本研究采用RNA干扰技术构建靶向hnRNP H-1，干扰RNA(siRNA)，转染子宫内膜癌Ishikawa细胞，敲低hnRNP H基因表达，探讨其对子宫内膜癌细胞增殖、细胞周期的影响，旨在为子宫内膜癌基因治疗寻找靶点。

1 材料与方法

1.1材料 人子宫内膜癌细胞株(Ishikawa)购于中国科学院上海细胞库，DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自GIBCO公司；hnRNP H siRNA、Control siRNA-A、siRNA转染试剂购自Santa Cruz公司；hnRNP H、增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白依赖蛋白激酶(CDK4)及细胞周期蛋白(CyclinD1)抗体均购自Santa Cruz公司。

1.2细胞培养 人子宫内膜癌Ishikawa细胞株由中国科学院上海细胞库提供，细胞经10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素DMEM培养基培养，37℃、5%CO2饱和度和湿度恒温培养箱中孵育。0.25%胰蛋白酶消化细胞传代，取对数生长期细胞。胰酶消化细胞计数，稀释细胞，使得细胞密度为4×105个/ml，铺于无菌6孔培养板中，培养12 h至Ishikawa细胞融合率达50%，弃去原细胞培养液，换无血清DMEM培养液，按转染试剂盒说明书要求用Transfection regent稀释hnRNP H siRNA、Control siRNA及转染试剂Transfection medium/regent。实验分组：正常培养Ishikawa细胞组(control)、转染hnRNP H siRNA细胞组、转染Control siRNA细胞株(Mock组)。转染试剂作用6 h，无血清培养基冲洗细胞，换含10%血清、抗生素培养基继续培养。于转染24 h后，分别搜集细胞提取总RNA及总蛋白待测。

1.3实时定量PCR检测各蛋白 mRNA水平表达 转染后24 h，提取总RNA，测定A260/A280值介于1.8～2.0间。以肌动蛋白(β-actin)作为内参，总RNA 浓度为1 mg/ml进行逆转录，将cDNA为模版进行PCR反应，PCR反应条件：预变性95℃ 10 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，目的基因30个循环，内参循环数设定为25循环。扩增完毕，溶解曲线进行分析，以β-actin为内参，利用CT值计算各组hnRNP H mRNA相对值。用2-△△CT表示。各目的基因引物序列-hnRNP H：5′-TGCCAAATATGAATAACGACCCA-3′，5′-GAGAAAAGTGCTCGTCACTGT-3′；PCNA: 5′-AAACTAGCTAGACTTTCCTC-3′ ，5′-TCACGGCCATGGCCAGGTTG-3′，CDK4:5′-CTGTGGACATGTGGAGTGTTG-3′和5′-GGCAGAGATTCGCTTGTGTG-3′,CyclinD1:5′-CTGTCCTACTACCGCCTCAC-3′和5′-CACCTCCTCCTCCTCCTCTT-3′内参引物序列5′-GGTCCTACGTTCACCAACACA -3′，5′- CTCTGGGTCACATGGCTCT -3′。

1.4Western印迹法检测各目的基因蛋白水平表达 转染24 h后，提取各组细胞，预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，于冰上进行操作，细胞裂解液裂解细胞，提取蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量，各组取等量细胞总蛋白于12%+二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白，半干法转至硝酸纤维素(NC)膜，含5%脱脂奶粉Tris盐酸盐缓冲液(TBS)室温封闭1 h， hnRNP H(鼠抗1∶200，SANTA CRUZ)PCNA(鼠抗1∶500，SANTA CRUZ)、CDK4(兔抗1∶500，SANTA CRUZ)、CyclinD1(兔抗1∶500，SANTA CRUZ)和GAPDH(兔抗1∶2 000，Abcam)，4℃过夜；二抗(羊抗鼠或羊抗兔1∶5 000)37℃ 1.5 h；增强化学发光法(ECL)显色 ，凝胶成像系统扫描分析。

1.5四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测细胞存活率 将呈对数期生长的子宫内膜癌Ishikawa细胞计数，以5×103/ml，每孔100 μl接种于96孔板，于37℃、5%CO2恒温无菌培养箱中继续培养，12 h细胞融合达70%，各组细胞按上述分组干预，各设3个复孔，继续培养24 h，每孔加入浓度为5 mg/ml MTT 10 μl，继续培养4 h，弃去培养液后每孔加入二甲基亚砜150 μl，微量振荡器震荡30 min，酶标仪测定各孔的吸光度A值(A570)，及细胞存活率。

1.8统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行χ2检验。两组均数比较采用成组设计t检验，多样本均数比较采用单因素方差分析，分析时间浓度效应采用析因涉及的方差分析。

2 结 果

2.1hnRNP H siRNA转染后目的基因在蛋白及mRNA水平的表达 Control组设为1，转染hnRNP H siRNA 24 h后hnRNP H 蛋白(0.170±0.053)表达明显降低约为Mock组(0.985±0.026)的(17±5.3)% ，转染hnRNP H siRNA 24 h后hnRNP H 表达在mRNA水平(0.210±0.032)明显降低约为Mock组(0.993±0.024)的(21±3.2)%。见图1。

2.2hnRNP H siRNA转染后细胞增殖及周期相关蛋白在蛋白及mRNA水平的表达 结果所示转染hnRNP H siRNA 24 h后增殖及周期相关蛋白PCNA，CDK4及CyclinD1 表达明显降低分别约为对照组的(70±2.1)%，(61±1.9)%，(30±5.4)%，见图2。转染hnRNP H siRNA 24 h后增殖及周期相关蛋白PCNA，CDK4及CyclinD1 表达在mRNA水平明显降低结果以2-△△CT表示分别为 0.79±0.121，0.57±0.004，0.23±0.106(图3)。

图2 hnRNP H siRNA转染后PCNA、CDK4、Cyclin D1在蛋白水平的表达

2.3hnRNP H siRNA转染后24 h对细胞存活率的影响 Control组设为1，转染hnRNP H siRNA 24 h后细胞存活率(0.560±0.054)显著降低，约为Mock组(0.987±0.017)的 (56±5.4)%。

图3 hnRNP H siRNA转染后PCNA、CDK4、Cyclin D1在mRNA水平的表达

3 讨 论

子宫内膜癌的发病原因不明，hnRNPs是一族高度保守的核蛋白家族，同RNA多聚酶Ⅱ转录产生的hnRNP颗粒密切相关，参与DNA、RNA、miRNA等多种生物行为。尤其影响哺乳动物的主要基因表达，家族成员与选择性转录剪切、翻译后修饰相关，其中研究较多的是hnRNP A/B亚家族，多种癌症相关研究中均有其不同作用。目前相关报道，hnRNP F/H亚家族与hnRNP A/B亚家族功能相似〔7〕。hnRNP H在肝癌、胰腺癌、喉癌中均被证实过表达〔8,9〕，但国内外报道中较少文献涉及子宫内膜癌。本系列研究已证实子宫内膜癌组织及Ishikawa细胞检测hnRNP H过表达，现通过干扰RNA技术转染至子宫内膜癌Ishikawa细胞，敲低hnRNP H基因表达，转染hnRNP H siRNA 24 h后hnRNP H 蛋白表达明显降低MTT检测对照组、阴性对照组、siRNA组细胞存活率，Western印迹检测转染hnRNP H siRNA 24 h后增殖及周期相关蛋白PCNA、CDK4及CyclinD1 表达明显降低，且在mRNA水平也明显降低。增殖细胞核抗原具有DNA多聚酶辅助因子的功能，是细胞周期调控蛋白，反映细胞增殖程度，表明PCNA过度表达与子宫内膜癌细胞增殖呈正相关，参与子宫内膜癌细胞侵袭作用，沉默hnRNP H基因检测PCNA蛋白表达下降，提示敲低hnRNP H基因能有效抑制子宫内膜癌细胞侵袭能力。CDKs调节细胞增殖分化，与其调控结合蛋白(Cyclin)发生异常时，导致肿瘤发生，表现为细胞增殖异常、分化调控异常〔10〕。本研究结果表明CDK4、CyclinD1过度表达与子宫内膜癌恶性转化及侵袭行为呈正相关〔11〕，沉默hnRNP H基因检测CDK4、Cyclin D1蛋白明显低于未转染组，说明敲低hnRNP H基因可阻滞细胞周期转化，抑制子宫内膜癌细胞细胞周期调节失控。

综上所述，沉默hnRNP H基因能有效抑制子宫内膜癌细胞侵袭能力，阻滞肿瘤细胞向S期转化，hnRNP H基因可能成为子宫内膜癌基因治疗的潜在靶点。

4 参考文献

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