七叶皂苷钠诱导人单核白血病SHI-1细胞凋亡的研究

王少娟 林筱洁 尹利明 高瑞兰

1浙江中医药大学 杭州 310053 2浙江中医药大学附属第一医院血液病研究所

七叶皂苷钠诱导人单核白血病SHI-1细胞凋亡的研究

王少娟1林筱洁2尹利明2高瑞兰2

1浙江中医药大学 杭州 310053 2浙江中医药大学附属第一医院血液病研究所

目的研究七叶皂苷钠对人急性单核白血病细胞株SHI-1细胞的抑制增殖及诱导凋亡的作用。方法SHI-1细胞经不同浓度的七叶皂苷钠处理后，MTT法分析七叶皂苷钠对SHI-1细胞增殖的抑制作用，AnnexinⅤ/PI染色流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡率，DNA凝胶电泳观察凋亡特异性DNA降解梯形条带，半定量PCR检测凋亡特异性酶Caspase-3 mRNA表达水平。结果MTT法显示七叶皂苷钠能显著抑制SHI-1细胞的增殖，呈时间和剂量依赖性（P<0.05）。经不同浓度的七叶皂苷钠处理24h，AnnexinⅤ/PI染色显示AnnexinⅤ阳性的凋亡细胞率明显上升，DNA琼脂糖凝胶电泳分析出现凋亡特异性的DNA降解梯形条带，半定量PCR显示Caspase-3 mRNA表达水平随药物浓度增加而升高（P<0.05）。结论七叶皂苷钠对SHI-1细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用，可能是其抗白血病作用途径之一。

SHI-1细胞；凋亡；七叶皂苷钠

七叶皂苷钠（Sodium aescinate）是从七叶树科中国天师栗Aesculus wilsonii Rehd、欧洲七叶树Aesculus hippocastanum L、日本七叶树Aesculus turbinate Blume和浙江七叶树Aesculus chinensis Bunge var.chekiangensis，Hu et Fang干燥成熟果实娑罗子中提取的天然三糖苷类化合物的钠盐，具有具有消炎、抗渗出、恢复毛细血管通透性、提高静脉张力、改善血液循环、促进脑功能恢复及神经保护等作用[1]。七叶皂苷钠在临床上应用广泛，国内主要用于治疗脑水肿、脑梗死、颅脑外伤及肢体肿胀等疾病[2]。曾报到七叶皂苷钠对白血病细胞株Jurkat、HL-60细胞有抑制增殖的作用，而且其作用呈时间和剂量依赖性[3-4]，但对侵袭性强的人单核白血病SHI-1细胞株的研究尚未报道。本研究观察七叶皂苷钠抑制SHI-1细胞增殖和诱导凋亡的作用，为其抗白血病作用提供实验依据。

1 实验材料

1.1 SHI-1细胞 由江苏省血液病研究所惠赠。将人急性单核细胞白血病细胞株SHI-1细胞悬浮生长于10%小牛血清的IMDM培养液中，含青霉素（100U/mL）和链霉素（100U/mL），置 37℃、5%CO2孵箱中培养。每2～3天换液1次，以维持良好的生长状态。

1.2 七叶皂苷钠注射液 由绿叶制药股份公司生产，从中药天师栗的成熟果子中提取，批号：1208154。

1.3 仪 器 细胞培养箱（美国Forma Scientific公司）、移液器（法国Gilson公司）、普通光学显微镜（日本Olympus公司）、倒置显微镜（日本Olympus公司）、超净工作台（苏州净化设备有限公司）、酶标仪（美国Bio-Tek仪器公司）、FACSCalibur流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司）。

2 实验方法

2.1 噻唑蓝（MTT）比色实验 取对数生长期良好的SHI-1细胞，按5×104/孔的密度接种于96孔培养板中，分别用 0、10、20、30、40、50mg/L 浓度的七叶皂苷钠处理SHI-1细胞24、48h，每组设3个复孔，每孔加入5mg/mL的MTT 20μL，培养4h后，弃去培养基，每孔加 DMSO 150μL，振荡 10min，于酶标仪上490nm波长，测定各孔吸光度OD值，0mg/L浓度为对照组，下同。

2.2 AnnexinⅤ/PI双染法检测细胞凋亡 SHI-1细胞经 0、10、20、30、40mg/L 浓度的七叶皂苷钠处理24h，收获细胞，冷PBS洗2次，加500μL结合缓冲液，混匀后加入5μL Annexin V-FITC和5μL PIFITC工作液，避光染色10min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2.3 DNA ladder法检测细胞凋亡 SHI-1细胞经0、10、20、30、40、50mg/L 浓 度 的 七 叶 皂 苷 钠 处 理24h，收获细胞，经冷PBS洗涤后，加入细胞裂解液50μL（1mmol/L EDTA、10mmol/L Tris-HCl、1%NP-40，PH 7.5），1600g/min 离心，取上清，加入 RNase A（终浓度 100μg/mL）和 10%SDS（终浓度 1%SDS），56℃水浴2h。加入10mg/mL的蛋白酶K（终浓度250μg/mL），37℃水浴2h。然后采用1.2%琼脂糖凝胶、电压30V电泳5h。

2.4 半定量RT-PCR检测Caspase-3mRNA表达SHI-1 细胞经 0、10、20、30、40、50mg/L 浓度的七叶皂苷钠处理24h，收获细胞，经冷PBS洗涤后，按Trizol试剂说明书提取总RNA，紫外分光光度仪检测RNA浓度和纯度，测A260/A280在1.8～2.0。RT-PCR反应：cDNA的合成：根据反转录试剂盒说明书操作。PCR扩增混匀后置PCR仪上扩增，扩增条件：94℃变性 5min，随后 94℃变性 30s，58℃退火 30s，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸7min退出。Caspase-3 上游引物 5’-GAACTGGACTGTGGCATTGAG-3’，下游引物 5’-CAAAGCGACTGGATGAACCA-3’，产物为161bp，以β-actin为内参。1.5%琼脂糖电泳，拍照。

3 实验结果

3.1 七叶皂苷钠对SHI-1细胞抑制增殖的作用 经不同浓度七叶皂苷钠处理SHI-1细胞24、48h后，细胞存活率呈时间和浓度依赖关系，见表1。

表1 不同浓度七叶皂苷钠在不同时间点对SHI-1细胞增殖的影响（±s）

表1 不同浓度七叶皂苷钠在不同时间点对SHI-1细胞增殖的影响（±s）

注：与对照组比较，*P<0.05

组别对照组七叶皂苷钠组n/孔3 3 3 3 3 3浓度（mg/L）0 10 20 30 40 50 24h（A=490）1.06±0.02 0.96±0.03 0.90±0.01*0.68±0.00*0.48±0.02*0.30±0.01*48h（A=490）1.43±0.03 1.32±0.07 1.19±0.02*0.86±0.01*0.52±0.05*0.14±0.02*

3.2 七叶皂苷钠对SHI-1细胞凋亡的影响

3.2.1 AnnexinⅤ/PI双染法检测 10、20、30、40mg/L七叶皂苷处理SHI-1细胞20h后，Annexin-V细胞阳性表达率均高于对照组（P<0.05），且40mg/L浓度，细胞数量明显减少，见表2。

表2 不同浓度七叶皂苷钠对SHI-1细胞凋亡的影响（±s） %

表2 不同浓度七叶皂苷钠对SHI-1细胞凋亡的影响（±s） %

注：与对照组比较，*P<0.05

组别对照组七叶皂苷钠钠组n/孔3 3 3 3 3浓度（mg/L）0 10 20 30 40早期凋亡率3.43±0.58 6.76±0.41*8.43±1.25*11.96±1.18*16.63±0.20*晚期凋亡率2.23±1.62 3.33±0.51*5.63±0.05*6.03±0.35*10.46±0.50*

3.2.2 DNA ladder法检测 七叶皂苷处理SHI-1细胞24h后，30、40mg/L处理的SH-1细胞中出现明显的DNA梯形条带，提示七叶皂苷可使细胞内源性核酸内切酶活性增高，将核小体之间的DNA切割成180～200bp的多聚体，见图1（封二）。

3.2.3 Caspase-3 mRNA表达 用半定量RT-PCR方法检测caspase-3 mRNA含量，以β-actin作为内参，见图 2（封二）。

4 讨论

细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是细胞在各种死亡信号刺激后发生的一系列瀑布式激活的主动性死亡过程，它与肿瘤的发生、发展有着密切的关系[5]。近年来，诱导白血病细胞凋亡已经成为治疗白血病研究的新方向。

本实验发现七叶皂苷钠具有抑制SHI-1细胞增殖及诱导凋亡的作用，抑制率呈时间和剂量依赖性。细胞凋亡过程中，细胞膜的不对称性消失，磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞内转移到细胞外，使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外，与钙离子依赖性的磷脂结合蛋白Annexin V结合，故Annexin V可检测早期凋亡细胞。碘化丙叮（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但能穿过凋亡晚期和死细胞胞膜，使之着色，故Annexin V与PI匹配使用可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来[6]。研究显示，40mg/L组早期凋亡率最高，而浓度到50mg/L组细胞数量明显减少，表明较低剂量的七叶皂苷能诱导SHI-1细胞凋亡，并与药物呈时间和剂量依赖关系，而较高剂量则具有杀伤白细胞的作用。细胞凋亡的一个典型特征是染色体DNA在核小体之间被切断，产生的DNA长度为180～200bp的整倍数，电泳呈梯形条带[7]。本实验在30、40mg/L组显示DNA降解梯形条带。

细胞凋亡受多种基因调控，并与Caspase-3家族密切相关。Caspase为半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶的简称，根据Caspase在凋亡中的作用分为两大类：启动性Caspase和效应性Caspase，Caspase-3即为效应性Caspase，它除了参与细胞因子成熟，细胞生长和分化之外，还与细胞凋亡密切联系。Caspase级联反应在细胞凋亡通路中处于重要地位，尤其是Caspase-3是其中的中心环节。Caspase-3是目前发现Caspase成员中引起细胞凋亡的关键性激酶，也是细胞凋亡的主要参与成分[8]。七叶皂苷钠通过何种途径诱导人单核SHI-1细胞凋亡，尚需进一步实验研究。

［1］Sirtori CR.Aescin：pharmacology，pharmacokinetics and thera-peutic profile［J］.Pharmacol Res，2001，44（3）：183-93.

［2］侯广平，迟广明.七叶皂苷的药理作用及其主要临床应用［J］.中国药师，2004，7（3）：206-208.

［3］万贵平，张真真.七叶皂苷钠抑制人白血病Jurkat细胞增殖的机制研究［J］.中草药，2012，43（1）：106-109.

［4］成志，高瑞兰.七叶皂苷诱导HL-60细胞凋亡的研究［J］.中国实验血液学杂志，2008，16（2）：290-293.

［5］Popadic S，Popadic D，Ramic Z，et al.Chloramphenicol induces in vitro growth arrest and apoptosis of human keratinocytes［J］.Cell Biol Toxicol，2006，22（5）：371-379.

［6］Van Engelang M，Nielang LJ，Ramaekers FC，et al.Annexin V affinity assay：a review on an apoptosis detection system based on phosphatidylserine exposure［J］.Cytometry，1998，31（1）：1-9.

［7］Saraste A，Pulkki K.Morphologic and biochemical hallmarks of apoptosis［J］.Cardiovasc Res，2000，45（3）：528-537.

［8］Youle RJ，Strasser A.The BCL-2 protein family:opposing activities that mediate cell death［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2008，9（1）：47-59.

Apoptosis of Human Acute Monocytic Leukemic SHI-1 Cells Induced by Sodium Aescinate

WANG Shao juan1,LIN Xiaojie2,YIN Liming2,GAO Ruilan2.1 Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou(310053),China;2 The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University

ObjectiveTo investigate the effects of sodium aescinate on inhibiting proliferation and inducing apoptosis of human acute monocytic leukemic SHI-1 cells.MethodsProliferation of sodium aescinate treated SHI-1 cells was detected by MTT method.The apoptosis rates of SHI-1 cells were analyzed by flow cytometry after annexinⅤ/PI staining.The gel electrophoresis of DNA ladder was used to analyze the bands of DNA degradation,and the expression level of caspase-3 mRNA was tested by reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）.ResultsMTT assay showed that the proliferation of SHI-1 cells was effectively inhibited by sodium aescinate in a time-and-does dependent manner（P<0.05）.The AnnexinⅤpositive rate of SHI-1 cells after treated with sodium aescinate was significantly increased by FCM analysis（P<0.05）.The apoptosis typical DNA fragments of SHI-1 cells treated with sodium aescinate was presented on the gel electrophoresis.The expression level of caspase-3 mRNA was up-regulated with increasing concentration of sodium aescinate by RT-PCR detection（P<0.05）.ConclusionTreatment with sodium aescinate can have inhibitory effect on proliferation and induce apoptosis of SHI-1 leukemia cells.Our results provides an experimental evidence for the activity of sodium aescinate on anti-leukemia.

SHI-1 cells；apoptosis sodium；aescinate

2013-07-21