HPLC 法测定N-(2-羟乙基)烟酰胺中的有关物质

2014-09-11吴保祥黄东王昉

中国医药科学 2014年11期

吴保祥黄东王昉

[摘要] 目的建立N-（2-羟乙基）烟酰胺中有关物质的测定方法。方法碳十八烷键合硅胶（5μm）填充4.0mm×25cm不锈钢柱；流动相为水∶四氢呋喃∶三乙胺∶三氟乙酸（982∶10∶5∶3）；检测波长：266nm；流速：1.0mL/min。结果 N-（2-羟乙基）烟酰胺与主要杂质能得到有效分离，各杂质在1.0～20μg/mL范围内呈良好线性关系。结论本测定方法灵敏度高，准确可靠，可以控制N-（2-羟乙基）烟酰胺中有关物质的含量。

[关键词] N-（2-羟乙基）烟酰胺；有关物质；系统适用性

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）11-92-03

Related substances determination of N-(2- hydroxyethyl) nicotinamide by HPLC

WU Baoxiang1 HUANG Dong1 WANG Fang2

1.Jiangsu Tasly Diyi Pharmaceutical CO., Ltd, Huaian 223002,China;2.Analytical＆Testing Center of Nanjing Normal University, Nanjing 210046,China

[Abstract] Objective To establish an HPLC method for detection of N-(2-hydroxyethyl) nicotinamide related substances. Methods The analytical column was C18 column (4.0mm×25cm, 5μm); The mobile phase was water: THF∶triethylamine∶trifluoroacetic acid = 982∶10∶5∶3; The wavelength was 254nm; The flow rate was 1.0 mL/min. Results A satisfactory separation condition for the five related impurities, the impurities standard curve was good linear in the range of 1.0-20μg/mL .Conclusion The method is sensitive and accurate and it can be used to determine the relateted substances of nicorandil.

[Key words] N-(2-hydroxyethyl) nicotinamide; Related substances; System suitability

N-（2-羟乙基）烟酰胺为类白色或浅米黄色结晶或粉末，味甘，易溶于水，易吸湿。是生产尼可地尔重要的中间体，其质量的优劣直接决定尼可地尔成品的质量。尼可地尔（nicorandil），又名硝烟酯，化学名为N-（α-羟乙基）烟酰胺硝酸酯，是日本在1976年研制的烟酸类衍生物。它是一种钾通道激活剂，可以舒张动脉血管，同时又具有硝酸酯基结构，可以舒张静脉血管。目前，尼可地尔作为一种新型药物，在临床上广泛用于心绞痛、高血压等疾病的治疗，增加冠脉血流量，不影响血压、心率及传导，用于治疗心绞痛，与硝酸酯一样，烟浪丁可激活细胞质鸟苷酸环化酶，从而导致细胞内环磷酸鸟苷升高和细胞内钙的降低，同时引起血管平滑肌松弛。N-（2-羟乙基）烟酰胺原标准中只检查熔点，干燥失重等项目，不能全面控制产品的质量。本研究采用高效液相色谱法来测定N-（2-羟乙基）烟酰胺中的有关物质，按照ICH指南Q2A、Q2B，及

美国药典和欧洲药典的规定，需要对该方法进行验证，以评价方法能否满足N-（2-羟乙基）烟酰胺有关物质测定的准确性、可靠性和灵敏度要求。参考文献[1-7]方法，本研究采用高效液相色谱法建立了N-（2-羟乙基）烟酰胺中有关物质的分析方法，并对该方法的专属性、精密度、线性、回收率、检测限和定量限等进行了验证，方法可行。

1 仪器设备与试剂试药

HPLC高效液相色谱仪系统：沃特斯高效液相色谱仪2489检测器，2695分离单元（四元泵、717自动进样器、柱温箱）；软件：Empower3 工作站，HP1008打印机。

尼可地尔工作标准品（20100701）；四氢呋喃（色谱纯200808066，美国天地公司）；三乙胺（色谱纯08071，美国默克公司）；三氟乙酸（色谱纯09012，美国默克公司），N-（2-羟乙基）烟酰胺工作对照品（lot：20100601，含量：99.0%中间体）；烟酸（lot：1309101，含量：99.5%），烟酸乙酯（lot：NK1307001a，含量：99.2%）。

图1 分离度色谱图

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：C18（5μm）25cm×4.0mm。流速为1.0mL/min；检测波长为266nm。流动相∶水∶四氢呋喃∶三乙胺∶三氟乙酸（982∶10∶5∶3）；进样量：10μL。

2.2 溶液制备

取20mg N-（2-羟乙基）烟酰胺用流动相溶解并稀释至10.0mL容量瓶中作为样品溶液。取10μL样品溶液注入液相色谱仪，系统适应性：灵敏度测试准确量取1.0mL样品溶液，加入流动相制成50.0mL作为系统适应性溶液。吸取1.0mL系统适应性溶液，加入流动相准确制成20mL作为仪器灵敏度测试液，各取10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，在灵敏度测试图谱中，烟酸乙酯峰面积约为系统适应性测试图谱中N-（2-羟乙基）烟酰胺峰面积的2%~8%。

2.3 系统适应性试验系统测试

取10mg烟酸、烟酸乙酯用流动相制成10mL，吸取1mL加入10mL样品溶液，按上述条件进行测试，烟酸与N-（2-羟乙基）烟酰胺分离度应不小于2.0，系统重复性试验：取10μL系统适应性溶液，按上述条件测试连续进样6次。记录色谱图，按峰面积计算，N-（2-羟乙基）烟酰胺峰面积相对平均偏差不超过2.0%。空白测试：取稀释溶剂10μL进样，作为溶剂空白，考察溶剂对杂质测定有无干扰，样品测定中溶剂空白产生的峰应忽略。

2.4 方法的专属性

2.4.1 杂质及N-（2-羟乙基）烟酰胺的分子结构确认（委托南京师范大学分析中心检测）通过紫外分光光度计、液相色谱-质谱、红外分光光度计等方法进行结构解析确证各杂质的分子结构[2]。

2.4.2 单个杂质的定性分别取N-（2-羟乙基）烟酰胺（lot：NK131002b，含量：99.0%中间体）10mg至一个50.0mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，混合均匀。进样，记录N-（2-羟乙基）烟酰胺的保留时间，用保留时间对N-（2-羟乙基）烟酰胺进行定性。烟酸乙酯（lot：NK1307001a，含量：99.2%）10mg至一个25.0mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，混合均匀。进样，记录烟酸乙酯的保留时间，用保留时间对烟酸乙酯进行定性。烟酸（lot：1309101，含量：99.5%）10mg至一个50.0mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，混合均匀。进样，记录烟酸的保留时间，用保留时间对烟酸进行定性。在分别取以上三种溶液5mL至同一个50mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，进样，记录色谱图，计算各组分的分离度，各杂质的分离度和理论板数都符合规定。

2.5 强制降解试验

分别精密称取N-（2-羟乙基）烟酰胺样品细粉20mg分别置于20mL容量瓶中，共5份，分别在强酸1、2、3、5h、强碱1、2、3、5h、强氧化1、2、3、5h高温、光照1、3、5、10d等条件进行强制降解实验，用溶剂稀释至刻度，即得1.0mg/mL的溶液，以上样品分别用液相色谱仪进样测定，由色谱图可看出各破坏条件下的降解产物与N-（2-羟乙基）烟酰胺主成分峰均有良好的分离[3]。

2.6 精密度和重复性

在重复性测试项下，取标准溶液连续重复6次进样，按峰面积计算，各组分峰面积的RSD均小于2.0%；在中间精密度测试项下，另一人取标准溶液连续重复6次进样，按峰面积计算，各组分峰面积的RSD均小于2.0%；不同人员之间，峰面积的RSD均小于2.0%。表明重复性和中间精密度两者之间的没有显着性差异。重复性和中间精密度均符合规定。

2.7 N-（2-羟乙基）烟酰胺及其杂质的线性关系考察

各组分标准贮备液：分别精密称取以下标准品：N-（2-羟乙基）烟酰胺（lot：NK131002b，含量：99.0%中间体），烟酸乙酯（lot：NK1307001a，含量：99.2%），烟酸（lot：1309101，含量：99.5%）10.0mg，分别到一个50mL容量瓶中，加入稀释溶剂超声溶解并稀释至刻度，混合均匀，即得。每个组分的浓度均约为200.0μg/mL。

精密量取各组分对照品的贮备液0.5，1，2，4，6，8，10mL分别至7个100mL容量瓶中，用溶剂稀释至刻度，制成浓度分别为1、2、4、8、12、16、20μg/mL的一系列溶液，摇匀，各精密量取10μL，注入液相色谱仪。记录各浓度的色谱峰面积，以峰面积A对浓度C（μg/mL）进行线性回归，得N-（2-羟乙基）烟酰胺的有关物质的回归方程分别为：烟酸A=56291.3C-136.1，r=0.9995；烟酸乙酯A=40428.1C+296.01，r=0.9990。结果表明有关物质烟酸及有关物质烟酸乙酯在1～20μg/mL的范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.8 加样回收实验

精密称取已测定有关物质含量的样品适量，共3份，分别置100mL棕色容量瓶中，加适量溶剂溶解，然后各精密加入有关物质对照品的贮备液1.6mL，2.0mL和2.4mL，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，按“样品有关物质测定”项下的方法分别测定有关物质的含量，减去样品本底，计算回收率，结果测得的平均回收率分别为：烟酸为99.5%，RSD=0.93%（n=9）；烟酸乙酯为99.0%，RSD=1.3，（n=9）；N-（2-羟乙基）烟酰胺为98.6%，RSD=1.1%（n=9）。

2.9 杂质检测限、定量限的测定

在选定的色谱条件下，按信噪比为3对最低检测限进行测定，结果表明：烟酸的浓度为4.30×10-3μg/mL，进样量为10μL时，最低检测限量为0.3ng。烟酸乙酯浓度为6.52×10-3μg/mL，进样量为10μL时，最低检测限量为0.6ng。按信噪比为10对最低定量限进行测定，结果表明烟酸的浓度为2.51×10-2μg/mL，进样量为10μL时，最低定量限量为0.5ng。烟酸乙酯的浓度为5.25×10-2μg/mL，进样量为10μL时，最低定量限量为0.8ng。其他未知杂质的检测限和定量限以N-（2-羟乙基）烟酰胺来进行评价，依次为0.05ng和0.01ng。

2.10 样品的稳定性

取N-（2-羟乙基）烟酰胺0.10mg·mL样品溶液存放在冷处分别于0、3、5、10、20h和50h进样测定。记录色谱图，按面积归一化法计算样品溶液中的杂质。结果有关物质含量与初始溶液相比无明显变化，RSD为1.0%，而且没有降解产物出现，结果表明，样品放置2~8℃下，2d稳定性良好。

2.11 样品有关物质测定（表1）

表1 样品中有关物质测定结果（%）

名称批号

NK1305001b NK1305002b NK1305003b

烟酸 0.02 0.01 0.02

烟酸乙酯 0.01 0.02 0.01

单个最大未知杂质 0.02 0.01 0.02

总杂质 0.08 0.06 0.07

取样品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进样测定，记录色谱图至主成分保留时间的2.5倍。按面积归一化法计算单一杂质及总杂质的含量，N-（2-羟乙基）烟酰胺样品杂质含量测定结果符合欧洲药典European pharmacopoeia7.0规定[7]。

3 讨论

取N-（2-羟乙基）烟酰胺工作标准品、烟酸工作对照品、烟酸乙酯用溶剂溶解稀释制成溶液，在200~400nm波长扫描，N-（2-羟乙基）烟酰胺在266nm处有最大吸收峰，烟酸在262nm处有最大吸收峰；烟酸乙酯在273nm处有最大吸收峰，在266nm处两个杂质均有较大吸收峰，所以选择254nm作为本品有关物质的检测波长[8-9]。

实验时曾试用日常检验常用的色谱柱AngilentODS C18柱及Diamonsil C18柱进行测定，结果发现前者的烟酸乙酯峰的拖尾因子为2.10，后者的烟酸乙酯峰拖尾1.1，分离度也较好，可获得满意的结果，说明本法对色谱柱有一定的选择性[10-11]。

本实验采用高效液相色谱HPLC法检查N-（2-羟乙基）烟酰胺有关物质[12]，能较好的分离N-（2-羟乙基）烟酰胺中主成分、各中间体和分解产物，方法简便，专属性良好。方法可用于药物稳定性考察和N-（2-羟乙基）烟酰胺产品的放行[13-14]。

[参考文献]

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[2] 阎平，谢剑炜.高效液相色谱法测定盐酸噻吩诺啡有关物质的方法研究[J].分析试验室，2006，25（12）：8-10.

[3] 王建，洪利娅，倪坤仪.液相色谱-蒸发光散射-电喷雾离子阱质谱法测定硫酸异帕米星及其有关物质[J].分析化学，2006，34（9）：19-22.

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[4] 张冬梅，陈秋芬.氨酚曲马多口腔崩解片中有关物质的HPLC测定[J].中国医药工业杂志，2007，38（1）：36-38.

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[7]European Pharmacopoeia Commission. European pharmacopoeia[S]. 5.0.ed.Publisher: EDQM，2005.