丁酸钠对乳腺癌细胞MCF-7生长抑制的影响

苏标+徐庆微+黄志力+张国祥

[摘要] 目的 探讨丁酸钠对乳腺癌细胞MCF-7生长的抑制作用。 方法 将乳腺癌细胞MCF-7常规培养至对数生长期，采用浓度为0、2.5、5.0、10.0mmol/L的丁酸钠处理后，观察对MCF生长的抑制作用。结果 浓度为2.5、5.0、10.0mmol/L的丁酸钠处理的MCF-7细胞生长速度明显慢于亲本细胞，随着浓度的增加呈减慢趋势，差异有统计学意义（P＜0.05）。浓度为5mmol/L的丁酸钠处理后的MCF-7细胞克隆形成率明显低于MCF亲本细胞，差异有统计学意义（P＜0.05）。丁酸钠处理的细胞G1明显高于亲本细胞，S期及G2/M期明显低于亲本细胞，凋亡细胞百分比明显高于亲本细胞，差异有统计学意义（P＜0.05）。 结论 丁酸钠可能是通过诱导MCF-7细胞凋亡而起到逆转其恶性生物学行为的作用。

[关键词] 丁酸钠；乳腺癌细胞；MCF-7；抑制

[中图分类号] R737.9   [文献标识码] A   [文章编号] 2095-0616（2014）11-33-04

The inhibitory effect of sodium butyrate on MCF-7 breast cancer cells growth

SU Biao  XU Qingwei  HUANG Zhili  ZHANG Guoxiang

Department of General Surgery, Guangzhou City Liwan District People's Hospital, Guangzhou 510000, China

[Abstract] Objective To investigate the inhibitory effect of sodium butyrate on the growth of breast cancer cells MCF-7. Methods Breast cancer MCF-7 cells were cultured to logarithmic growth phase, they were processed with sodium butyrate, 0, 2.5, 5.0, 10.0mmol/L were the concentration, the growth inhibition of MCF was observed. Results The growth rate of MCF-7 cell processed with the sodium butyrate with the Concentration 2.5, 5.0, 10.0mmol/L was significantly slower than that of the parent cell, the growth rate with increasing concentration was slower, there was the significant difference(P＜0.05). The colony efficiency of MCF-7 cells processed with the sodium butyrate with the concentration 5mmol/L was significantly lower than that of the parental cells, there was the significant difference (P＜0.05). After processed with sodium butyrate, Cell G1 was significantly higher than the parental cells, S phase and G2 / M phase were significantly lower than the parental cells, the percentage of apoptotic cells was significantly higher than the parental cells, there was the significant difference(P＜0.05). Conclusion Sodium butyrate may be by inducing apoptosis in MCF-7 cells and play a reversal of its role in the m alignant behavior.

[Key words] Butyrate; Breast cancer cells; MCF-7; Suppression

乳腺癌是一种常见的恶性肿瘤，严重影响女性的健康，近年来在世界范围内乳腺癌的发病率呈逐年上升趋势并且年龄逐渐年轻化[1-2]。丁酸钠为短链脂肪酸丁酸的钠盐，主要通过改变组蛋白的乙酰化程度来改变染色质结构，参与多种基因的表达[3]。部分食物在人体没有经过小肠消化，厌氧菌对上述食物中的碳水化合物及蛋白分解发酵后即可产生丁酸钠，其在结肠上皮细胞的能量来源中占有较大比例，使结肠肽或生长因子的释放受到刺激，对结肠黏膜血供进行调节，促进上皮细胞的增殖[4]，但有报道表明，丁酸钠还具有抑制肿瘤细胞增殖及诱导细胞衰老与凋亡等作用[5-8]。笔者为了探讨乳腺癌

细胞MCF-7生长是否会受到丁酸钠的抑制，将乳腺癌细胞MCF-7采用丁酸钠处理后对其细胞生长速度、倍增时间等进行观察，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究时间段为2013年5~12月。乳腺癌细胞MCF-7提供单位：中科院上海细胞库；丁酸钠提供单位：美国Sigma公司，CAS号：156-54-7，采用高压灭菌的蒸馏水溶解，配成0、2.5、5.0、10.0mmol/L浓度，分装后放置于-20℃冻存；胎牛血清提供单位：杭州四季青生物工程材料研究所；胰蛋白酶、EDTA等提供单位：德国Merk公司；蛋白酶K、DNA分子量Markers等提供单位：美国Invitrogen公司，其余试剂均为国产分析级。

1.2 研究方法

1.2.1 生长速度和倍增时间的检测 常规消化对数生长期的MCF-7细胞，接种于24孔培养板，每孔接种1×104个细胞，共接种72孔，在温度为37℃、5%CO2孵箱中孵育24h。处理细胞的丁酸钠的浓度分别为0、2.5、5.0、10.0mmol/L。每组药物浓度均设3个复孔，各浓度计数3孔细胞/d，采用Microsoft Excel软件计算各浓度各时间的平均值及标准差。做细胞生长的柱形图，将培养时间（d）及细胞数分别作为柱形图的横纵坐标，按照以下公式计算倍增时间：TD（倍增时间）=t（Nt与N0间隔时间）*log2/[logNt（培养后的细胞数）-logN0（起始时间细胞数）]。

1.2.2 平板克隆形成率 取对数生长期的MCF-7亲本细胞接种于6个平皿，每平皿接种1×102个细胞，在温度为37℃、5%CO2条件下培养24h，将其中3个平皿的细胞用浓度为5.0mmol/L的丁酸钠处理24h，同时设对照组，即剩余的3个平皿不采用丁酸钠处理，在相同条件下培养21d，固定使用甲醛溶液，Gimesa染色。将平均克隆数计算出来并根据平均克隆数及接种细胞数得出克隆形成率（为平均克隆数与接种细胞数的比值与100%的乘积）。

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1.2.3 细胞周期及凋亡的测定 取对数生长期MCF-7亲本细胞常规消化，接种于6个培养瓶，每瓶接种5×105个细胞，在37℃，5%CO2的条件下培养24h后，将其中的3瓶细胞采用浓度为5.0mmol/L的丁酸钠进行处理，同时设对照组，即为剩余的3瓶细胞，在相同条件下培养24h后收集不同处理组的细胞。在4℃的条件下细胞采用浓度为70%的乙醇固定过夜。用预冷的PBS在染色前洗3次。将200μL浓度为1mg/mL的 RNase A加入，在37℃条件下温育30min。将800μL浓度为100ng/mL的碘化丙锭（PI）染色液混匀后加入，在避光4℃条件下放置30min。DNA的含量采用流式细胞仪（CouIter-profilo II型）测定，细胞周期分布及细胞凋亡情况采用Multicycle DNA含量及细胞周期分析软件分析。

1.3 观察指标

（1）MCF-7细胞生长速度，倍增时间；（2）克隆形成率；（3）细胞周期：G1、S期、G2/M期；（4）凋亡细胞百分比。

1.4 统计学处理

将研究所得数据输入计算机，建立数据库，采用SPSS16.0统计学软件处理，符合正态分布的计量资料采用（）表示，采用F检验对多组间差异进行比较，采用t检验对两组间差异进行比较，采用x2检验对计数资料组间差异进行比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对MCF-7细胞生长速度及倍增时间的影响

2.1.1 对MCF-7细胞生长速度的影响 浓度为2.5、5.0、10.0mmol/L的丁酸钠处理的MCF-7细胞生长速度明显慢于亲本细胞，随着浓度的增加呈减慢趋势，差异有统计学意义（F=17.15，P＜0.05）。见图1。

图1  丁酸钠对MCF-7细胞生长的抑制作用

2.1.2 各种浓度丁酸钠对MCF-7倍增时间的影响 MCF-7亲本细胞的倍增时间为（30.1±2.6）h、2.5mmol/L丁酸钠处理的MCF-7倍增时间为（65.8±4.7）h、5mmol/L丁酸钠处理的MCF-7倍增时间为（171.6±9.5）h、10mmol/L丁酸钠处理的MCF-7倍增时间为（304.2±13.1）h。各种浓度丁酸钠处理的MCF-7倍增时间均明显高于MCF-7亲本细胞的倍增时间，差异有统计学意义（F=12.86，P＜0.05），并且倍增时间随着丁酸钠浓度的升高也呈现升高趋势。

2.2 对MCF-7细胞克隆形成率的影响

MCF-7亲本细胞平均形成（69.5±10.4）个细胞克隆，平均细胞克隆形成率为69.5%，而浓度为5mmol/L的丁酸钠处理后的MCF-7细胞平均形成（17.8±3.2）个细胞克隆，平均细胞克隆形成率为17.8%，浓度为5mmol/L的丁酸钠处理后的MCF-7细胞克隆形成率明显低于MCF亲本细胞，差异有统计学意义（x2=9.37，P＜0.05）。

2.3 对MCF-7细胞细胞周期的影响

丁酸钠处理的MCF-7细胞G1明显高于亲本细胞，S期及G2/M期明显低于亲本细胞，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.4 对MCF-7细胞凋亡的影响

丁酸钠处理的凋亡细胞百分比明显高于亲本细胞，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表1  对MCF-7细胞细胞周期的影响（）

组别 G1 S期 G2/M期

亲本细胞 52.6±1.3 37.9±0.4 10.3±0.9

处理后的MCF-7细胞 81.3±0.7 13.2±0.2 5.4±0.6

t 6.07 3.71 4.58

P ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

表2  对MCF-7细胞凋亡的影响

组别 总细胞数 凋亡细胞数 凋亡细胞百分比（%）

亲本细胞 10 798 18 0.17

丁酸钠处理的细胞 9352 1816 19.42

x2 11.38

P ＜0.05

3 讨论

肿瘤治疗方法的疗效通常取决于两个关键因素，即治疗靶点的有效性和对肿瘤细胞的选择性[9]。现行肿瘤化疗、放疗以细胞的核苷酸、蛋白代谢或DNA为治疗作用靶点，没有选择性，难以避免毒副作用强，宿主与肿瘤之间治疗窗小的缺点。为此，针对新的分子靶点设计高效、低毒的肿瘤治疗新方法，已成为目前肿瘤治疗领域发展的主导趋势[10-12]。寻找肿瘤细胞特异性分子靶点是本领域目前待解决的关键难题。体外培养的恶性肿瘤细胞生长速度较快，倍增时间较短及无限的体外传代能力是其典型的恶性生物学特征，所以，减慢细胞的生长速度及延长倍增时间等策略对体外培养的恶性肿瘤细胞来讲是效果较好的肿瘤治疗方法[13-14]。

本次研究表明，浓度为2.5、5.0、10.0mmol/L的丁酸钠处理的MCF-7细胞生长速度明显慢于亲本细胞，随着浓度的增加呈减慢趋势，浓度为5mmol/L的丁酸钠处理后的MCF-7细胞克隆形成率明显低于MCF亲本细胞，丁酸钠处理的细胞G1明显高于亲本细胞，S期及G2/M期明显低于亲本细胞，丁酸钠处理的凋亡细胞百分比明显高于亲本细胞，以上差异均有统计学意义（P＜0.05）。谢瑞莲等[7]观察组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠对人乳腺癌细胞株MCF-7细胞增殖的影响，结果表明，采用不同浓度丁酸钠处理乳腺癌MCF-7细胞后均有显著的抑制增殖作用，并且作用时间越长、所用丁酸钠剂量越大则抑制MCF-7细胞作用越明显，细胞出现凋亡形态变化，该研究结果与本次研究结果具有一致性。MCF-7细胞为人乳腺癌细胞株，生长增殖旺盛，由研究结果可见，其一，乳腺癌细胞MCF-7采用丁酸钠处理后能够抑制其生长。计算克隆形成率以便更好的了解细胞的群体依赖性及增殖能力，根据肿瘤细胞中恶性程度不同，恶性程度较高的与恶性程度低的比较明显较强[15-16]；其二，采用丁酸钠处理乳腺癌细胞MCF-7后降低了平均细胞克隆率，使其增殖能力受到抑制。丁酸钠是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，使癌细胞乙酰化的平衡状态被打破，癌细胞发生凋亡。其三，采用丁酸钠处理后明显影响了MCF-7细胞的细胞周期分布，G1期细胞升高，S期细胞降低，提示采用丁酸钠处理后抑制了细胞的DNA合成，将其阻滞在G1期，使恶性增殖受到抑制。反应恶性肿瘤恶性生物学活性的各项指标中生长速度、倍增时间、克隆形成率及细胞周期分布变化等具有重要的意义[13，17-18]。细胞凋亡会影响个体的发育及某些疾病的发生发展，肿瘤是一种凋亡受阻性疾病，所以，在肿瘤的治疗方面阻滞细胞的增殖周期，使其增长受到抑制，诱导肿瘤细胞凋亡增加为一个抗癌药物研究的重要方向。其四，丁酸钠处理乳腺癌细胞MCF-7能使其恶性生物学行为受到抑制。总之，丁酸钠可能是通过诱导MCF-7细胞凋亡而起到逆转其恶性生物学行为的作用。

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（收稿日期：2014-04-14）

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（收稿日期：2014-04-14）

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