HPLC法测定补肾强身片中原儿茶酸的含量

1.云南省临沧市食品药品检验所，云南 临沧 677000；2.云南省曲靖市食品药品检验所，云南 曲靖 655000；3.大理学院，云南 大理 671000

HPLC法测定补肾强身片中原儿茶酸的含量

穆天慧1方慧祥2黎海存3

1.云南省临沧市食品药品检验所，云南 临沧 677000；2.云南省曲靖市食品药品检验所，云南 曲靖 655000；3.大理学院，云南 大理 671000

目的建立高效液相色谱法测定补肾强身片中原儿茶酸的含量方法。方法采用色谱柱为Agilent HC-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈-1%冰醋酸(3.5∶96.5)； 柱温为30℃；流速：1.0ml.min-1；检测波长：260nm；进样量：10μl。结果原儿茶酸回归方程Y=3081.5151X-0.9753，r=0.9998(n=5)，浓度在0.05888～0.35328μg.ml-1范围内线性关系良好，平均回收率97.7﹪，RSD为0.96﹪。结论HPLC法准确、快速，简便可靠，可用于补肾强身片中原儿茶酸的含量测定。

HPLC法；补肾强身片；原儿茶酸；含量测定

补肾强身片由淫羊藿、菟丝子、金樱子、女贞子、狗脊(烫)五味中药组成，具有补肾强身的功效，用于腰酸足软，头晕耳鸣，眼花心悸，阳萎遗精 。现行质量标准为《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第十五册(WS3-B-2907-98)，其标准简单，无含量测定的项目[1]。为更好地控制补肾强身片的质量，确保临床疗效，参照中国药典[2]及文献[3，4]，建立HPLC法测定补肾强身片中原儿茶酸的含量的方法，本实验选择原儿茶酸为指标，用HPLC法对补肾强身片进行含量测定。

1 仪器与试剂

Agilent Technologies 1200 Series高效液相色谱仪(G1311A四元泵，G1329A自动控温进样器，G1316A柱温箱，G1315D二极管阵列检测)；超声波淸洗仪(中船七院七二六所)；塞多利斯CP324S电子天平。原儿茶酸对照品(批号：809-9201，中国药品生物制品检定所)。乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，冰醋酸为分析纯。补肾强身片(批号：201206003、201206004、201206006，葵花药业集团)和阴性样品。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Agilent HC-C18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：乙腈-1%冰醋酸(3.5∶96.5)；流速：1.0ml.min-1；柱温：30℃；检测波长：260nm；进样量：10μl。原儿茶酸的保留时间约为15.32min 。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取原儿茶酸对照品0.0184g，置50ml容量瓶中，加甲醇-1%冰醋酸(70∶30)使溶解，并稀释至刻度，摇匀，再精密量取2ml，置50ml容量瓶中，加甲醇-1%冰醋酸(70∶30)稀释至刻度，摇匀，即得0.01472mg.ml-1原儿茶酸对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取补肾强身片30片，去糖衣，精密称定，研细，精密称取细粉约2.5g(相当于10片的量)置150ml具塞锥形瓶中，加入0.1mol/L的盐酸3ml润湿10min，加乙酸乙酯20ml超声30min，方冷，滤过，残渣用乙酸乙酯10ml洗涤，合并滤液与洗涤液，水浴上蒸干，残渣加甲醇-1%冰醋酸(70∶30)溶解，定溶至25ml容量瓶中，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 按处方比例及制法，取除狗脊(烫)的其他药材，制得阴性样品。再按供试品溶液的制备方法制成阴性对照样品溶液。

2.3 线性实验 吸取2.2.1项下对照品溶液，用0.45μm的微孔滤膜滤过。分别精密吸取滤液4、10、16、20、24μl进样，浓度分别为0.05888、0.14720、0.23552、0.29440、0.35328μg.ml-1。以浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归。结果表明，原儿茶酸的浓度在0.05888～0.35328μg.ml-1范围内线性关系良好，Y=3081.5151X-0.9753，r=0.9998(n=5)。

2.4 精密度实验 精密吸取“2.2.1项”下对照品溶液10μl，连续进样6次，测原儿茶酸的峰面积，RSD为0.11%。表明所选色谱条件系统稳定。

2.5 空白实验 分别精密吸取对照品溶液，供试品溶液，阴性对照溶液各10μl进样，结果，在对照品和供试品色谱相应的保留时间，阴性样品无色谱峰，表明阴性样品不干扰测定。

2.6 稳定性实验 取同一样品，按照“2.2.2项”下制备，分别在0、4、10、16、24h测定峰面积，RSD为0.21%，说明原儿茶酸甲醇-1%冰醋酸(70∶30)溶液在24h内稳定性较好。

2.7 重复性实验 取同一批样品(批号：201206004)4份，按“2.2.2项”下制备，测定原儿茶酸的含量，其含量的RSD为0.31%。

2.8 加样回收率实验 取已知含量的补肾强身片细粉(批号：201206004) 4份，精密称定，加入原儿茶酸对照品适量，按“2.2.2项”下操作。测得原儿茶酸的回收率见表1。

表1 加样回收率实验测定结果(n=4)

2.9 样品测定结果 分别取3种不同批号的补肾强身片，按“2.2.2项”下的方法操作，以外标法计算原儿茶酸的含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果(n=3)

3 讨论

3.1 检测波长的选择 根据文献报道[3-4]及中国药典[2]，检测波长采用260nm。

3.2 流动相的考察 参考中国药典[2]及文献报道[3][4]，流动相为乙腈-1%冰醋酸(5∶95)和乙腈-0.2%磷酸溶液(4∶96)下都能出峰，但分离效果及峰形不理想，因此在反复验证及本实验环境下，流动相为乙腈-1%冰醋酸(3.5∶96.5)时，出峰的保留时间合适，分离效果及峰形较好，所以本实验的流动相比例为乙腈-1%冰醋酸(3.5∶96.5)。

3.3 提取方法的考察 第一种提取法参照中国药典[2]，精密称定样品后，再精密加入甲醇-1%冰醋酸(70∶30)混合溶液25 mL，称定重量，超声提取(功率300 W，频率45 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用甲醇-1%冰醋酸(70∶30)混合溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液进样分析；第二种提取法参考文献[3]即“2.2.2项”下的提取方法。第三种提取法按“2.2.2项”下的提取方法，将0. 1mol/L的盐酸3ml换为0.01 mol/L的盐酸10ml。按样品测定方法测定，含量分别为0.5020mg/片，0.5145mg/片，0.3792mg/片，且第一种方法提取的样品，杂峰多。根据上述结果，最终确定第二种提取方法为本试验的提取方法。

3.4 结论 该方法准确、快速，简便可靠，可用于补肾强身片中原儿茶酸的含量测定。

[1] WS3-B-2907-98.补肾强身片[S].1998.

[2] 国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)[M]．北京：中国医药科技出版社，2010：209.

[3] 南劲松，孙海涛，吴艳丽，等.高效液相色谱法测定补血调经片中原儿茶酸的含量[J].时珍国医国药，2009，20(2)：437-438.

[4] 林春华，朱品业，胡家炽，等.高效液相色谱法测定壮腰健肾丸原儿茶酸含量[J].中国中药杂志，1996，21(5)：288.

DeterminationofProtocatechuicacidinBushenqiangshentabletsbyHPLC

Mu Tian-hui1Fang Hui-xiang2Li Hai-cun3

1.Lincang Institute for Food and Drug control 677000；2.Qujing Institute for Food and Drug control 655000；3.Da Li Universerty 671000 ,Yunnan

Objective：To establish an HPLC method for determination of Protocatechuic acid in Bushenqiangshen tablets. Methods：The Agilent HC-C18 column(4.6mm×250mm，5μm)was used at a column temperature of 30℃. The mobile phase consisted of acetonitrile - 1% glacial acetic acid in water (3.5∶96.5) and detected with UV 260nm.The flow rate was 1.0mL·min-1and the injected volume was 10μL. Results： A good linear concentration range for Protocatechuic acid was 0.05888～0.35328 μg.mL-1(r=0.9998 ,n=5).The average recoveries was 97.7% with RSD of 0.96% . Conclusion：The method is rapid, simpie and accurate , which can be used for the quality control of Protocatechuic acid of Bushenqiangshen tablets.

HPLC；Bushenqiangshen tablets；Protocatechuic acid；determination

R285.6

A

1007-8517(2014)09-0013-02

2014.03.10)