白细胞介素-9在原发性胆汁性肝硬化患者中的表达及其临床意义*

肖 潇 卞兆连 苗 琪 王绮夏 张海燕 马 雄

上海交通大学医学院附属仁济医院消化内科 上海市消化疾病研究所(200001)

原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)是一种自身免疫介导的慢性胆汁淤积性肝病，临床表现以血清抗线粒体抗体(AMA)阳性、IgM升高、肝脏生化指标异常为特征，组织病理学表现为以小叶间胆管为中心的炎性细胞浸润、小胆管增生以及胆汁淤积，可慢性进展至肝纤维化，最终导致肝硬化[1]。目前PBC的发病机制尚未完全阐明，除遗传和环境因素外，自身抗体、多种免疫细胞以及细胞因子共同参与了疾病发生。白细胞介素-9(IL-9)因可促进T细胞、肥大细胞生长而被称为T细胞、肥大细胞生长因子，并被归入Th2型细胞因子。此外，IL-9还在变态反应性疾病和自身免疫性疾病(如哮喘、类风湿性关节炎、多发性硬化症等)中发挥多向免疫调节功能[2-3]。目前尚无关于IL-9与PBC的研究。本研究通过检测PBC患者血清和肝组织中的IL-9表达，分析其与临床指标和肝组织病理分期的关系，旨在阐明IL-9在PBC发生、发展中的作用。

对象与方法

一、 研究对象

纳入2012年1月-2013年7月上海交通大学医学院附属仁济医院消化内科确诊的PBC患者30例。根据2009年美国肝病研究学会(AASLD)更新的PBC诊断和治疗指南[4]，诊断PBC需符合下列3项诊断标准中的两项：①胆汁淤积的生化学表现；②AMA阳性；③非化脓性破坏性胆管炎和小叶间胆管损伤的组织学表现。30例患者中20例行肝穿刺活检，根据Scheuer评分系统[5]对标本进行病理分期：Ⅰ期为小胆管炎期，Ⅱ期为细小胆管增生期，Ⅲ期为瘢痕期，Ⅳ期为肝硬化期。选取同期10名健康体检者和4例来自肝血管瘤切除标本的远端正常肝组织作为正常对照组。研究方案经上海交通大学医学院附属仁济医院伦理委员会批准，患者本人或法定代理人签署知情同意书。

二、方法

1. 主要试剂：ELISA试剂盒购自美国Bio-Legend公司，兔抗人IL-9抗体购自美国Abcam公司，即用型免疫组化超敏试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。

2. 血清IL-9水平以及生化、免疫指标测定：抽取PBC组、正常对照组受检者外周静脉血5 mL，2 h内1 000×g离心10 min，提取上层血清保存于-80 ℃，采用ELISA法检测血清IL-9水平，具体步骤参照ELISA试剂盒说明书。采用自动生化仪和散射免疫比浊法检测血清生化和免疫指标，包括ALT、AST、ALP、GGT、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、IgG、IgM、IgA。

3. 肝组织IL-9免疫组化染色：取20例PBC、4例正常对照肝组织标本，4%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片，二甲苯、乙醇梯度脱蜡。PBS洗涤3次后，以3% H2O2作用15 min消除内源性过氧化物酶活性，柠檬酸盐缓冲液热修复 15 min，自然冷却至室温。非免疫羊血清室温封闭 30 min，滴加兔抗人IL-9抗体(1∶100)，4 ℃过夜，次日滴加二抗，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片。显微镜下(×400)随机选取5个门管区，计数每个门管区阳性细胞数量，取平均值行统计学分析。

三、统计学分析

结 果

一、一般情况

PBC组患者30例，其中男3例，女27例，年龄25～70岁，平均(47.3±15.6)岁。正常对照组10例，其中男2例，女8例，年龄26～66岁，平均(49.1±13.8)岁。两组间性别构成、年龄差异无统计学意义(P>0.05)。20例肝穿刺标本病理分期示Ⅰ期4例，Ⅱ期8例，Ⅲ期5例，Ⅳ期3例。

二、血清IL-9水平及其与生化、免疫指标的相关性

PBC组血清IL-9、ALT、AST、ALP、GGT、TBIL、DBIL水平均较正常对照组显著升高(P<0.05)(图1A、表1)。Pearson相关系数分析显示，PBC组血清IL-9与IgG水平呈正相关(r=0.681，P<0.01)(图1B)，与ALT、AST、ALP、GGT、TBIL、DBIL、IgM、IgA水平均无相关性(P>0.05)。

三、肝组织IL-9表达及其与病理分期的相关性

肝组织免疫组化染色结果显示，IL-9阳性染色主要定位于细胞质，呈棕褐色；正常肝组织几乎无IL-9阳性细胞，PBC肝组织中有少量IL-9阳性细胞，主要集中于门管区，两组间IL-9阳性细胞数量差异有统计学意义(P<0.01)(图2A、2B)。Spearman等级相关系数分析显示，门管区IL-9阳性细胞数量与肝组织病理分期呈正相关(rs=0.465，P<0.05)(图2C)。

表1 PBC组和正常对照组血清生化、免疫指标比较

讨 论

IL-9属于四螺旋束细胞因子家族，可由Th17、Th9、调节性T细胞(Treg细胞)等CD4+T细胞亚群合成、分泌[6]。IL-9受体(IL-9R)是由IL-9R α和γc链组成的异二聚体，广泛分布于Th9、Th17、Treg细胞、肥大细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞等表面。以IL-9/IL-9R轴为基础，IL-9可作用于不同免疫细胞，发挥多向免疫调节功能。对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠(多发性硬化模型)的研究[2]显示，中和小鼠体内IL-9可延缓疾病发生，而IL-9R缺陷可减轻疾病严重程度。Elyaman等[7]的研究发现，IL-9可由Th17细胞产生，并与转化生长因子-β1(TGF-β1)协同促进初始CD4+T细胞向Th17细胞分化，且不依赖于IL-6信号途径。Khan等[8]在类风湿性关节炎患者中检测到血清IL-9水平升高，予利妥昔单抗治疗后，IL-9水平明显降低。上述研究提示IL-9可能通过其受体在自身免疫性疾病中发挥促炎作用。此外，研究[7]还发现IL-9能增强Treg细胞在体外的免疫抑制功能，从而发挥抗炎作用。目前，关于IL-9与肝脏疾病的关系已有多项研究报道，如在药物引起的肝损伤中，IL-9水平降低与早期死亡率增加相关[9]；在肝移植患者中，IL-9水平升高者对免疫抑制剂的应答更好[10]。

A：PBC组、正常对照组血清IL-9水平比较；B：PBC组血清IL-9水平与IgG水平的相关性

A: PBC组、正常对照组肝组织IL-9免疫组化染色(×200)；B: PBC组、正常对照组肝组织门管区IL-9阳性细胞数量比较；C: PBC组肝组织中的IL-9阳性细胞数量与病理分期的相关性

PBC是一种以肝脏为相对特异性免疫病理损伤器官的自身免疫性疾病，其发病机制尚未完全阐明。随着实验小鼠模型的建立和新技术的发展，PBC相关免疫学机制得到了进一步的揭示。研究[11]发现自身反应性T细胞在dnTGF-β受体Ⅱ转基因小鼠模型和人类PBC肝组织中大量浸润，可能在胆管上皮损伤中起主要作用。多种CD4+效应T细胞和细胞因子失衡在PBC致病过程中亦发挥重要作用。PBC患者肝组织中的干扰素-γ(IFN-γ)、IL-17、IL-23 表达明显增加，而IL-10表达明显减少[12-13]。Kawata等[14]对2-辛炔酸-牛血清白蛋白耦合物(2OA-BSA)诱导的PBC小鼠模型的研究发现，敲除IL-12p40和IFN-γ可抑制胆管炎发生，提示IL-12、IFN-γ对胆管炎的发展至关重要。该研究进一步发现，IL-17A和IL-22缺失可减轻胆管炎症，提示IL-23/Th17通路可增强IL-12、IFN-γ介导的免疫损伤。此外，IL-2受体α(CD25)-/-小鼠是国际公认的PBC模型，对模型小鼠的研究提示Treg细胞(CD4+CD25+T细胞)功能缺陷可能在PBC的发病机制中发挥重要作用[15]。作为新近鉴定的CD4+效应T细胞和细胞因子，Th9细胞和IL-9是否参与PBC的致病过程尚未见报道。本研究发现，PBC患者外周血和肝组织中的IL-9均呈高表达，提示IL-9参与了PBC的致病过程。在PBC患者中，血清IgG水平可反映肝组织门管区炎症和小叶坏死程度[4]，肝组织病理分期则与肝纤维化程度密切相关。本研究相关性分析发现PBC患者血清IL-9水平与IgG水平呈正相关，提示血清IL-9水平亦能反映PBC肝组织门管区炎症程度，IL-9或参与了肝组织炎症损伤过程。此外，相关性分析还显示PBC肝组织中的IL-9阳性细胞数量与病理分期呈正相关，提示IL-9可能参与了PBC的肝组织纤维化过程。

综上所述，本研究结果提示IL-9可能在PBC肝组织炎症损伤和纤维化过程中发挥重要作用，然而IL-9是否通过Th17或其他靶细胞参与PBC的致病过程仍有待进一步研究。IL-9信号通路阻断剂或能成为PBC的靶向治疗药物。

1 Kaplan MM, Gershwin ME. Primary biliary cirrhosis[J]. N Engl J Med, 2005, 353 (12): 1261-1273.

2 Nowak EC, Weaver CT, Turner H, et al. IL-9 as a mediator of Th17-driven inflammatory disease[J]. J Exp Med, 2009, 206 (8): 1653-1660.

3 Soroosh P, Doherty TA. Th9 and allergic disease[J]. Immunology, 2009, 127 (4): 450-458.

4 Lindor KD, Gershwin ME, Poupon R, et al; American Association for Study of Liver Diseases. Primary biliary cirrhosis[J]. Hepatology, 2009, 50 (1): 291-308.

5 Scheuer P. Primary biliary cirrhosis[J]. Proc R Soc Med, 1967, 60 (12): 1257-1260.

6 Goswami R, Kaplan MH. A brief history of IL-9[J]. J Immunol, 2011, 186 (6): 3283-3288.

7 Elyaman W, Bradshaw EM, Uyttenhove C, et al. IL-9 induces differentiation of TH17 cells and enhances function of FoxP3+ natural regulatory T cells[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, 106 (31): 12885-12890.

8 Khan IH, Krishnan VV, Ziman M, et al. A comparison of multiplex suspension array large-panel kits for profiling cytokines and chemokines in rheumatoid arthritis patients[J]. Cytometry B Clin Cytom, 2009, 76 (3): 159-168.

9 Steuerwald NM, Foureau DM, Norton HJ, et al. Profiles of serum cytokines in acute drug-induced liver injury and their prognostic significance[J]. PLoS One, 2013, 8 (12): e81974.

10 Fábrega E, López-Hoyos M, San Segundo D, et al. Interleukin-9 in stable liver transplant recipients[J]. Transplant Proc, 2012, 44 (6): 1536-1538.

11 Oertelt S, Lian ZX, Cheng CM, et al. Anti-mitochondrial antibodies and primary biliary cirrhosis in TGF-beta receptor Ⅱ dominant-negative mice[J]. J Immunol, 2006, 177 (3): 1655-1660.

12 Nagano T, Yamamoto K, Matsumoto S, et al. Cytokine profile in the liver of primary biliary cirrhosis[J]. J Clin Immunol, 1999, 19 (6): 422-427.

13 Yang CY, Ma X, Tsuneyama K, et al. IL-12/Th1 and IL-23/Th17 biliary microenvironment in primary biliary cirrhosis: implications for therapy[J]. Hepatology, 2014, 59 (5): 1944-1953.

14 Kawata K, Tsuda M, Yang GX, et al. Identification of potential cytokine pathways for therapeutic intervention in murine primary biliary cirrhosis[J]. PLoS One, 2013, 8 (9): e74225.

15 Wakabayashi K, Lian ZX, Moritoki Y, et al. IL-2 receptor alpha(-/-) mice and the development of primary biliary cirrhosis[J]. Hepatology, 2006, 44 (5): 1240-1249.