exendin-4类似物EW的降糖活性的研究

唐玲 陆怡 吴晓琰

(1.上海市北站医院内科，上海 200070；2.复旦大学附属华山医院老年科，上海 200040)

中华医学会糖尿病学会2007年6月—2008年5月的一项全国性横断面调查研究[1]发现，我国糖尿病患者达9200万，20岁以上人群中年龄标化的糖尿病患病率高达9.7%，其中2型糖尿病占90%以上。据英国前瞻性糖尿病研究(UK prospective diabetes study，UKPDS)、糖尿病心血管风险控制行动(action to control cardiovascular risk in diabetes，ACCORD)及糖尿病和心血管病行动(action in diabetes and vascular disease，ADVANCE)报道，常用的6大类治疗糖尿病的药物(双胍类、磺脲类、格列奈类、噻唑烷二酮类、α-糖苷酶抑制剂及胰岛素)均不能长期有效地降低血糖，也不能阻止2型糖尿病及其并发症的进展[2-3]。此外，这些降糖药物的安全性也尚待阐明。

胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是由小肠黏膜分泌的多肽，多肽长30个氨基酸，餐后其在血清中的浓度迅速增高，半衰期1.5～2.1 min[4]。GLP-1对2型糖尿病患者有以下作用：血糖依赖性地刺激胰腺β细胞分泌胰岛素；增加胰腺β细胞体积；抑制胰腺α细胞分泌胰高血糖素及中枢性抑制食欲等。GLP-1由血浆中的二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase-4，DPP4)酶解，由肾脏及其他蛋白酶如人中性内肽酶24.11(neutral endopeptidase 24.11，NEP24.11)酶解清除，前者是主要途径[5]。GLP-1受体途径治疗是目前治疗糖尿病的新途径[5-9]。GLP-1受体途径药物包括GLP-1受体激动剂及DPP4酶抑制剂。

GLP-1受体激动剂exendin-4含39个氨基酸，与GLP-1受体结合并激活受体，模拟GLP-1的功能。其N端的序列是His、Gly，能够抵抗DPP4，半衰期3～5 h，是中效的抗糖尿病药物，具有良好的降糖作用，可单独应用或与其他口服抗糖尿病药物及胰岛素联用[10-15]。GLP-1还可使体质量持续减轻，并有助于改善多项心血管危险因素[16]。由于exendin-4较人源GLP-1的末端肽链延长了9个氨基酸，故有免疫源性，40%～50%患者注射后可在血浆中检测到不同滴度的抗体[17]。

Wu等[18-19]设计了一种新的exendin-4类似物EW(PCT/CN2009/001321)， 飞行质谱(MALDI-MS)分析证明符合设计，并在小鼠体内初步证实了其降糖活性。本研究旨在进一步研究EW的降糖活性及安全性。

1 资料与方法

1.1 实验动物 C57BL/6小鼠(雄性，8周，体质量约20 g)；db/db小鼠(雄性，8周，体质量约40 g)及昆明鼠(雄性，8周，体质量约30 g)均由中国科学院上海实验动物中心提供。饲养房间温度(22±2)℃，12 h照明/12 h黑暗循环，饮水，给予标准啮齿类动物饮食供应。动物实验遵循“北京医科大学动物照料及福利委员会”准则。

1.2 材料 分析纯葡萄糖(上海国药集团化学试剂公司)，葡萄糖测定试剂盒(北京鼎国生物技术有限公司)，人胰岛素及exendin-4(美国Lilly公司)。EW样品为本实验室通过大肠杆菌表达合成，见文献[18-19]。

1.3 方法

1.3.1 血浆葡萄糖测定方法 C57BL/6小鼠和db/db小鼠禁食18 h后，用毛细管取10 μL尾静脉血，转入肝素化微量离心管中，离心后将血浆保存于-20 ℃。采用葡萄糖氧化酶法测定血浆葡萄糖。

1.3.2 各药物在C57BL/6小鼠中的降糖作用 按照随机数字表，将C57BL/6小鼠随机分为3组(n=10)，取空腹血后每组小鼠分别腹腔注射EW(2 μg EW，100 μL的0.9%氯化钠液)、exendin-4(2 μg exendin-4，100μL的0.9%氯化钠液)、100 μL的0.9%氯化钠液；3组均于即刻及每隔2 h腹腔注射20%葡萄糖300 μL(60 μg)，共5次。每次腹腔注射葡萄糖后20 min取尾静脉血，测定血糖。

1.3.3 各药物在db/db小鼠中的降糖作用 按照随机数字表，将db/db小鼠随机分为3组(n=3)，取空腹血后每组小鼠分别腹腔注射低浓度EW溶液(2 μg EW，100 μL的0.9%氯化钠液)、高浓度EW溶液(5 μg EW，100 μL的0.9%氯化钠液)、100 μL的0.9%氯化钠液；3组均于即刻及每隔4 h腹腔注射20%葡萄糖300 μL(60 μg)，共3次。每次腹腔注射葡萄糖前及腹腔注射葡萄糖后30 min取尾静脉血，测定血糖。

1.3.4 C57BL/6小鼠中EW对胰岛素的增敏作用 C57BL/6小鼠禁食18 h后，按照随机数字表将其随机分成6组(n=3)。其中3组毛细管取10 μL尾静脉血，测得血糖为基础血糖(base)，取血后每组小鼠分别腹腔注射胰岛素0.3、1.0、2.0 μg，随后即刻腹腔注射20%葡萄糖300 μL(60 μg)，腹腔注射葡萄糖后20 min取10 μL尾静脉血，测定血糖；另外3组C57 BL/6小鼠取空腹血后每组小鼠(n=3)分别腹腔注射胰岛素0.3 μg、EW 0.2 μg、胰岛素0.3 μg+EW 0.2 μg后，即刻腹腔注射20%葡萄糖300 μL(60 μg)，腹腔注射葡萄糖后20 min取10 μL尾静脉血，测定血糖。

1.3.5 EW的急性毒性实验 按照随机数字表将昆明鼠随机分为3组(n=10)，每组分别一次腹腔注射EW 0.1 mg/100 μL的0.9%氯化钠液、EW 0.2 mg/100 μL的0.9%氯化钠液及100 μL的0.9%氯化钠液，观察小鼠1周内存活数量。

2 结 果

2.1 各药物在C57BL/6小鼠中的降糖作用 腹腔注射葡萄糖前EW组、exendin-4组及0.9%氯化钠液组平均血糖分别是(6.39±1.37)mmol/L、(5.87±1.16)mmol/L及(6.18±1.15)mmol/L (P>0.05)。4次葡萄糖注射后，0.9%氯化钠液组平均血糖逐渐上升至(25.04±2.10)mmol/L ，而EW组及exendin 4组平均血糖分别是(8.54±2.10)mmol/L 及(6.93±1.84)mmol/L，后2组间差异无统计学意义，但2组与0.9%氯化钠液组比较差异有统计学意义(P<0.01)。0、2、4、6 h腹腔注射葡萄糖后，EW组及exendin-4组血糖均维持在正常范围内，8 h腹腔注射葡萄糖后EW组及exendin-4组血糖明显上升，2组间差异无统计学意义，但与0.9%氯化钠液组差异仍有统计学意义(P<0.01)。见图1。

2.2 各药物在db/db小鼠中的降糖作用 腹腔注射葡萄糖前EW 2 μg组、EW 5 μg组及0.9%氯化钠液组平均血糖分别是(21.33±5.10)mmol/L、(20.46±3.15)mmol/L 和(19.37±2.92)mmol/L (P>0.05)。第1次腹腔注射葡萄糖30 min后，0.9%氯化钠液组血糖显著上升至(26.9±4.75)mmol/L，而EW 2 μg组及EW 5 μg组平均血糖分别为(18.16±1.90)mmol/L及(12.87±2.63)mmol/L，与0.9%氯化钠液组比较差异有统计学意义(P<0.01)，且EW 2 μg组及EW 5 μg组间差异有统计学意义(P<0.01)，EW治疗剂量增大，降糖效果明显。第1次腹腔注射葡萄糖1 h后，0.9%氯化钠液组平均血糖为(22.23±3.52)mmol/L，而EW 2 μg组及EW 5 μg组平均血糖分别为(15.00±2.72)mmol/L 及(10.87±1.59)mmol/L，与0.9%氯化钠液组比较差异有统计学意义(P<0.01)，且EW 2 μg组及EW 5 μg组差异仍有统计学意义(P<0.01)，EW 5 μg组降糖效果较好。第一次腹腔注射葡萄糖4 h后EW 2 μg组、EW 5 μg组与0.9%氯化钠液组平均血糖差异均有统计学意义(P<0.01)，EW 2 μg组及EW 5 μg组间差异亦有统计学意义(P<0.01)。第2次腹腔注射葡萄糖30 min后测定平均血糖，EW组与0.9%氯化钠液组差异有统计学意义(P<0.01)，且EW 2 μg组及EW 5 μg组间差异仍有统计学意义(P<0.01)。第5次腹腔注射葡萄糖8 h后EW 2 μg组、EW 5 μg组与0.9%氯化钠液组平均血糖差异无统计学意义(P>0.05)。第3次腹腔注射葡萄糖30 min后测定平均血糖，EW组与0.9%氯化钠液组差异有统计学意义(P<0.01)，且EW 2 μg组及EW 5 组差异仍有统计学意义(P<0.01)。见图2。

图1 腹腔注射5次60 μg葡萄糖后C57BL/6小鼠的血糖水平

图2 腹腔注射3次60 μg葡萄糖后db/db小鼠的血糖水平

2.3 C57BL/6小鼠中EW对胰岛素的增敏作用 胰岛素的降低血糖作用呈剂量依赖性，当胰岛素剂量为0.3 μg时，无明显降糖效果，而当胰岛素剂量为2 μg时，降糖效果明显。见图3右图。当注射胰岛素0.3 μg及EW 0.2 μg时发现血糖无明显下降，而当注射胰岛素0.3 μg+EW 0.2 μg时血糖下降明显，说明EW对胰岛素有增敏作用。见图3左图。

图3 EW对胰岛素的增敏作用

2.4 安全性 昆明鼠腹腔注射0.1 mg EW/100 μL的0.9%氯化钠液、0.2 mg EW/100 μL的0.9%氯化钠液及0.9%氯化钠液后观察1周，所有小鼠均存活，证明应用EW安全。

3 讨 论

exendin-4可与GLP-1受体结合而激活受体，它的N-端序列(His、Gly、Glu)不被DPP4所识别(DPP4通常迅速切断GLP-1的N-端的His、Ala、Glu序列)，exendin-4在体内半衰期比GLP-1长。将exendin-4缩短至32个氨基酸，并更换一些氨基酸，设计得到exendin-4类似物EW，将EW串联后在E.coli中表达，通过胰蛋白酶定点切断获得重组EW，EW分子量为3581.5 Da。

C57BL/6小鼠是具有2型糖尿病倾向的小鼠模型，其基线血糖基本正常，给糖后其血糖水平明显高于正常鼠模型昆明鼠。本研究显示，EW在C57BL/6小鼠体内有良好的降糖活性，仅1次给予EW或exendin-4后，每隔2 h给予糖负荷，降糖作用可保持6 h以上，而且2 μg的EW与2 μg的exendin-4降糖效果无显著差异。这表明EW的降糖作用及有效作用时间与exendin-4相当，故exendin-4 C-端的7个氨基酸对于exendin-4在体内的生物活性并非必须。32个氨基酸的EW，从长度和结构而言，更接近人源的GLP-1；从理论上而言，可以减少过敏反应的产生，增加安全性。1次给予2 μg的EW，无明显低血糖反应，证明EW的降糖机制是血糖依赖的，故避免了低血糖，增加了安全性。1次给予2 μg的EW后，反复给予60 μg葡萄糖，血糖保持稳定8 h，说明EW是一个中效的抗糖尿病药物。

db/db小鼠是2型糖尿病鼠模型，空腹血糖即有增高，给糖后血糖进一步增高。本研究显示，EW在db/db小鼠中有血糖依赖的降糖作用，无明显低血糖反应，增加EW剂量可以使降糖效果更为显著。

本研究在C57BL/6小鼠中，进一步将小剂量的EW与小剂量的胰岛素合用，结果发现，EW对胰岛素有增敏作用。目前对exendin-4增加胰岛素敏感性的研究并不多，有待进一步研究。

昆明鼠是正常小鼠模型，本研究对昆明鼠腹腔注射超大剂量的EW，所有小鼠均存活，验证了EW的安全性。

综上所述，EW具有良好的生物体内降糖活性及安全性，是一种很有前景的抗糖尿病药物，它能通过基因工程大规模廉价的生产获得，值得进一步研究。

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