转化生长因子β3对椎间盘退变大鼠软骨终板的作用研究

余作冲 熊敏 吴靖平 张新潮 尹望平 范卫 史继明

(复旦大学附属金山医院骨科，上海 201508)

椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IVDD)是脊柱退行性疾病发生的病理基础[1]。目前，椎间盘退变的具体机制尚不明确。治疗椎间盘退变的药物或手段较多[2]，目前对转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)的研究是热点。TGF-β是一种多肽类细胞因子，具有调节细胞增殖和分化、促进细胞外基质形成和抑制免疫反应等作用。TGF-β3能促进骨髓基质干细胞和软骨的前体细胞向软骨细胞分化，并促进软骨细胞合成软骨基质。因此，TGF-β3具有较强的促进软骨修复的功能。本研究通过在椎间盘退变大鼠的软骨终板中注射TGF-β3，观察软骨终板细胞的凋亡情况，从而探讨TGF-β3在椎间盘退变中的作用。

1 资料与方法

1.1 椎间盘退变大鼠模型的建立 87只新生的SD大鼠为上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供的15只预产期为同日的孕鼠的子代，于出生后24～48 h内截去双前肢，3周龄后移走母鼠停止哺乳。此后，根据大鼠的不同生长阶段采用相应的饲养条件，并使其养成只有依靠双后肢站立才能进食和饮水的生活习惯，以此训练大鼠的直立活动，使其发生椎间盘退变[3]。见图1。

图1 双后肢站立大鼠模型

1.2 模型建立成功与否验证 SD大鼠饲养18个月后，随机选取5只，腹腔内注射戊巴比妥钠后处死，立即取腰段脊柱，剔除周围附着的肌肉等组织，将标本置入中性甲醛固定，然后置于10%乙二胺四乙酸-磷酸缓冲液脱钙，室温放置3周，切片，并用苏木素-伊红(HE)染色，在光学显微镜下观察腰段椎间盘髓核细胞及纤维环细胞形态，如髓核和纤维环退变，即可判断椎间盘退变大鼠模型建立成功(见图2)。

1.3 实验分组及TGF-β3注射 造模成功后，选取存活的SD大鼠中的60只，随机分成对照组、0.9%氯化钠组及TGF-β3组，每组20只。腹腔注射麻醉药物，消毒铺巾，背侧正中旁1.0 cm切开，上提大鼠棘突，肌间隙内分离暴露腰3、4节段椎体侧前方；用20 μ L的微量注射器在0.9%氯化钠液组和TGF-β3组大鼠软骨终板内及周边分别注射TGF-β3(100 ng/mL)和0.9%氯化钠液各160 μ L(上下终板各80 μ L，前、后、左、右各20 μ L)，注射后于腰3、4椎体间缝线标记；每周注射1次，连续3次。

1.4 蜡块及切片制备 戊巴比妥钠腹腔内注射后处死60只模型鼠，立即整段截取腰3、4椎体及椎间盘(缝线标记处)，剔除周围附着的肌肉等组织；将标本置入中性甲醛中固定24 h，制备蜡块并切片。

1.5 Tunel染色 将切片脱蜡至水，用20 μg/mL蛋白酶K透明处理，室温孵育25 min，3%H2O2甲醇溶液封闭，滴加Tunel染色反应液(设阴性对照组，用PBS替代反应液)，漂洗后加底物3,3′-二氨基联苯胺(DAB)显色10 min，苏木素复染，脱水透明、封片(试剂盒由德国MERCK公司提供)。

1.6 细胞计数 200倍光镜下，每张切片中选取阳性细胞较多的数个视野，数500个细胞，计数凋亡细胞个数，以百分数表示细胞凋亡指数(AI)。

2 结 果

对各组软骨终板组织行Tunel染色(见图3)后，计算各组AI。对照组、0.9%氯化钠液组及TGF-β3组的终板软骨细胞AI分别为(26.60±4.98)%、(60.65±5.28)%、(44.25±5.85)%。0.9%氯化钠液组的AI高于对照组(P<0.05)；TGF-β3组AI低于0.9%氯化钠液组(P<0.05)，但高于对照组(P<0.05)。见图4。

100倍光镜示髓核外形皱缩，体积变小，部分出现裂隙, 局部有片状变性坏死区域(见箭头①)，髓核组织中出现大量软骨样细胞(见箭头②)

A.对照组凋亡的软骨终板细胞核呈棕褐色改变，散在分布；B.TGF-β3组棕褐色的细胞数较对照组多；C.0.9%氯化钠液组棕褐色的细胞数较TGF-β3组多；D.对照组。

图4 软骨终板细胞的凋亡指数(AI)

3 讨 论

3.1 软骨终板退变对椎间盘退变的影响 椎间盘是由终板、髓核及纤维环三部分组成，纤维环包绕胶冻样髓核，二者上下方为软骨终板。软骨终板是是承担身体重力负荷的重要结构及髓核的主要营养来源，其硬化、钙化或增厚均可影响椎间盘的结构及营养物质的代谢，从而引发椎间盘退变[4]。软骨终板细胞是软骨细胞的一种,其表型与关节软骨细胞类似,均可表达Ⅱ型胶原及蛋白多糖[5]。

3.2 针刺创伤对软骨终板退变的影响 有研究[6]用针刺方法建立鼠椎间盘退变模型，发现大号针头可导致椎间盘高度丢失，髓核黏多糖减少，髓核胶原增加 。本研究中0.9%氯化钠液组和TGF-β3组软骨终板细胞AI较对照组高，这可能与针刺创伤可促进软骨终板的退变有关。

3.3 细胞调亡在椎间盘软骨终板退变中的作用 细胞凋亡可能参与椎间盘组织退变的病理生理过程，是退变椎间盘组织中细胞数量减少的主要原因[7]。其机制之一是：软骨终板细胞凋亡使椎间盘内Ⅱ型胶原蛋白生成减少，导致椎间盘退变[8]。本研究对造模成功大鼠的软骨终板组织行Tunel染色，镜下可见对照组有散在的终板凋亡细胞，证实了上述结论。

3.4 TGF-β3对椎间盘软骨终板细胞凋亡的抑制作用 研究[9]表明，TGF-β3具有很强的促进软骨生长及分化的作用。Bouffi等[10]的研究发现，TGF-β3能够诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)向软骨细胞分化。TGF-β3还可以通过调节TGF-β1/β2比例，抑制成纤维细胞的增殖，抑制组织纤维化的发生[11]。有研究[12]认为，TGF-β3能有效地促进软骨细胞分泌软骨基质等。

3.5 本研究的不足 TGF-β3在体内降解较快，如何延长TGF-β3体内作用时间是我们今后工作的重点。针刺创伤因素可能会加重椎间盘退变，在临床治疗中是否可以通过靶向给药避免此类创伤？需要我们进一步探索。

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