光谱法研究头孢替唑钠与牛血清白蛋白相互作用

刘 里，成飞翔

(曲靖师范学院化学化工学院，云南 曲靖 655011)



光谱法研究头孢替唑钠与牛血清白蛋白相互作用

刘 里，成飞翔

(曲靖师范学院化学化工学院，云南 曲靖 655011)

在优化的实验条件下，运用荧光光谱和紫外-可见光谱法研究了头孢替唑钠(CS)与牛血清白蛋白(BSA)之间的相互作用.实验结果表明：CS与BSA形成基态复合物从而猝灭BSA 的内源性荧光，猝灭机理为静态猝灭.通过计算获得了二者在不同温度下的结合常数及结合位点数.通过计算反应热力学参数值，可推断CS与BSA 作用力主要为静电引力，生成自由能变ΔG为负值，表明CS与BSA的作用过程是一个自发过程.两者的结合部位主要位于亚螺旋域ⅡA中.Hill系数nH大于1，表明CE有正协同作用.同步荧光光谱表明CS对BSA构象不产生影响，结合位点更接近于酪氨酸.

头孢替唑钠；荧光猝灭；相互作用

0 引言

血清白蛋白是一类重要的运输性蛋白，在生物体内的循环系统中含量非常丰富，几乎占血清蛋白的60%[1-3].近年来采用光谱研究药物与血清白蛋白的相互作用已成为生命科学、化学、药学和临床医学领域的研究热点，这对于了解生命过程、药物作用机制及药物分子设计等都具有重要作用[4-5].因结构上和人血清白蛋白的相似性，牛血清白蛋白(简称BSA)[6]被广泛地运用于与药物结合作用的研究.头孢替唑钠(Ceftezole Sodium，简称CS)是治疗败血症、肺炎、支气管炎、肺脓症、腹膜炎、肾盂肾炎、膀胱炎等的常用药[7].因此，研究CS与BSA的相互作用对理解药物的作用机制具有重要意义.以往研究药物与BSA相互作用主要集中在猝灭机理探讨上，而本文在优化实验条件的情况下从更多角度研究了CS与BSA的结合反应，除了常规的作用机理的研究，还深入探讨了不同温度下两者的结合位点、结合力类型、结合部位、药物之间的协同性以及药物对蛋白质构象的影响等.

1 实验部分

1.1 主要实验仪器与试剂

F-4600荧光光谱仪(日本日立公司)，狭缝宽度10.0 nm，光电倍增管负电压为-400 V；Cary50型紫外-可见光谱仪(美国瓦里安技术中国有限公司);pHS-3C精密酸度计(上海虹益仪器仪表有限公司);DHG-9035A型超级恒温水浴(上海一恒科技有限公司).

牛血清白蛋白(BSA，上海楷样生物技术有限公司)，头孢替唑钠(质量分数为99.9%， 上海研生实业有限公司)，其它试剂为分析纯，实验用水为超纯水.

1.2 试验方法

在10.0 mL比色管中依次加入1.0×10-5mol·L-1的BSA溶液0.75 mL、1.0×10-4mol·L-1的不同体积的头孢替唑钠溶液、0.5 mol·L-1NaCl溶液2.0 mL(保持体系的离子强度)和pH值为7.4的Tris-HCl缓冲溶液2 mL，用水释至刻度并摇匀.放置 60 min后，分别在287、301、311 K温度下，测定荧光光谱，记录CS不存在与存在时体系的荧光强度F0和F.其最大激发波长(λex)和最大发射波长(λem)分别位于280 nm和332 nm 处.扫描Δλ=15 nm和Δλ=60 nm时体系的同步萤光光谱，以不含CS和BSA的溶液作为参比，记录CS-BSA体系的吸收光谱.

2 结果与讨论

2.1 反应条件的优化

2.1.1 缓冲溶液类型、pH值及用量的优化 考察浓度为0.01 mol·L-1，pH值为7.40的K2HPO4-KH2PO4、K2HPO4-柠檬酸、Tris-HCl、硼酸-硼砂及KH2PO4-NaOH缓冲溶液对反应体系的影响.结果表明，缓冲溶液对体系影响不大，使用Tris-HCl时效果最好(见图1).

在Tris-HCl缓冲范围(pH值为7.10～8.90)内，分别考察了pH值和缓冲溶液用量对体系的影响，结果见图2.结果表明：当pH值为7.35～8.50时(图2(A))，缓冲溶液用量在1.5～2.0 mL范围内(图2(B))，体系的F0/F达到最大且保持稳定，因人体正常生理pH值范围为7.35～7.45，所以实验选择pH值为7.40的Tris-HCl溶液2.0 mL作为缓冲溶液.

1.K2HPO4-KH2PO4;2.硼酸-硼砂;3.KH2PO4-柠檬酸;4.KH2PO4-NaOH;5.Tris-HCl. c(BSA)= 1.0×10-6 mol·L-1,c(CS)=2.0×10-5 mol/L.

c(BSA)= 1.0×10-6 mol·L-1,c(CS)=2.0×10-5 mol·L-1.

2.1.2 BSA浓度的优化 考察BSA浓度在1.0×10-7～1.5×10-6mol·L-1范围内对体系的荧光强度的影响(见图3).实验表明：BSA浓度在5×10-7～1.5×10-6mol·L-1范围内时，F0/F基本保持稳定且最大.因此实验选用7.5×10-7mol·L-1作为反应浓度.

c(CS)=2.0×10-5 mol·L-1.

2.1.3 试剂加入顺序的优化 实验分别研究了4种加入顺序，结果表明试剂加入顺序对体系的影响不大，实验选择BSA→CS→NaCl→Tris-HCl的加入顺序.

2.1.4 反应时间的优化 在以上优化条件下，考察反应时间对体系的影响，结果见图4.结果表明，CS与BSA需要60 min左右完成，4 h内基本稳定，故以下溶液配制后放置60 min后进行荧光测量.

图4 反应时间的影响

2.2 荧光猝灭光谱

在实验优化的条件下，考察CS对BSA荧光光谱的影响，结果见图5.CS在测量波段没有荧光，而BSA的荧光较强，并在λex/λem=280/340 nm处，当CS加入到BSA之后，虽然λex/λem几乎未发生变化，但是其荧光强度明显随着CS浓度的增加而逐渐减弱，表明CS能猝灭BSA的荧光，CS与BSA之间存在着相互作用.

1→13.c(BSA)=7.5×10-7 mol·L-1,c(CS)=(0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5) ×10-5 mol·L-1.

2.3 猝灭类型的判断

引起荧光猝灭的原因很多，但通常分为静态猝灭和动态猝灭[8-12].常用温度的改变而引起体系的变化来确定猝灭类型.在动态猝灭中分子扩散起主导，猝灭常数会随着温度的升高而增大；对于静态猝灭，因有新物质生成，稳定性起主导作用，温度越高，猝灭常数反而越小.猝灭过程遵循S-V方程：F0/F=1+KSV[C]=1+Kqτ0[C] ，其中KSV为猝灭常数；Kq为速率常数(动态猝灭时最大值约为2×1010L·mol-1·s-1)；τ0为荧光体平均寿命，一般为10-8s数量级；[C]为CS浓度.按照实验方法在287 K、301 K和311 K时以F0/F对[C]作图(见图6).根据Kq=Ksv/τ0可求出不同温度下的Kq值，结果列于表1中.表1所有温度下的Kq值比动态猝灭最大速率常数大2个数量级， 说明CS对BSA的猝灭不属于动态猝灭.由图6可知，3个温度下的Stern-Volmer曲线均呈良好的线性关系，且随着温度的升高，直线斜率即Ksv减小，正好与静态猝灭机理相吻合.

图7 3个不同温度下的S-V图

表1 S-V 线性回归方程的相关参数

若CS对BSA为静态猝灭，应符合L-B方程[13-15]： (F0-F)-1=F-10+(KLBF0[C])-1，其中KLB为静态猝灭结合常数.(F0-F)-1-[C]-1作不同温度下的L-B曲线，结果见图7.由图7可知，随着温度的升高，斜率逐渐增大，则KLB逐渐下降，这与因静态猝灭方式而形成的复合物随温度升高而越不稳定的作用机理相符.计算KLB值列于表2中，表2中3个温度下的KLB值都在103数量级以上，表明CS与BSA由于发生静态猝灭而结合力较强.

图7 不同温度下BSA-CS的L-B曲线

表2 L-B 线性回归方程的相关参数

紫外吸收光谱也是一种区分猝灭机理的重要方法，固定BSA浓度不变，改变CE的浓度，以相应浓度的CS为参比，在紫外-可见光谱仪上对体系进行紫外光谱扫描，可得到CS与BSA 结合后的紫外吸收光谱图，如图8所示.实验表明，CS的加入使BSA中苯环上的π-π*跃迁引起的特征吸收峰从276 nm蓝移到264 nm，吸收强度也随CS浓度的加大而明显增加.CS的加入引起BSA紫外吸收光谱的变化这一现象，说明CS与BSA间发生了反应，有新物质生成，更进一步证明两者之间的相互作用机理属于静态猝灭机理.

c(BSA)= 7.5×10-6 mol·L-1,c(CS)=(0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3,5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5) ×10-5 mol·L-1.

2.4 结合常数和结合位点数

如药物小分子与BSA大分子存在n个等同且独立的结合位点，它们相互作用的关系符合lg[(F0-F)/F]= lgKb+nlg[C]公式[13-15].分别在287 K、301 K、311 K温度下，以lg(F0-F)/F对lg[C]作图，由直线的斜率和截距可求出CS与BSA不同温度下的结合常数Kb及结合位点数n，结果见表3.由表3可知，3个温度下的n都约等于1，表明CS与BSA结合后可形成一个结合位点.随着温度增加，Kb和n值减少的程度不大，表明CS与BSA的相互作用对温度变化不是很敏感.总之，温度的提升不利于血清白蛋白携带着CS在体内进行运转、贮存和分配.

表3 CS-BSA的Kb和n

2.5 热力学常数及结合力类型

静电引力、疏水作用力、氢键和范德华力等是药物小分子与蛋白质大分子的主要结合作用力.把结合反应的焓变ΔH看作是一个常数(温度变化范围不大时)[13-17]，根据热力学公式计算287 K、301 K和311 K温度下CS与BSA结合反应的ΔH、熵变ΔS及吉布斯自由能变ΔG， 结果见表4.根据P.D.Ross等总结出的的规则判断，由表4可得，ΔG<0表明BSA与CS的反应能自发进行；ΔH<0，表明反应为放热反应；ΔS>0，表明其过程是熵增加的自发过程；ΔH<0且ΔS>0，表明静电作用力是CS与BSA的主要结合作用力.

表4 不同温度下CS与BSA相互作用的热力学参数

2.6 结合位置的确定

与人血清白蛋白相似，BSA含有3个α-螺旋域(Ⅰ～Ⅲ) ，每个α-螺旋域包含2个亚螺旋域 A 和 B.为确定药物小分子与BSA具体结合的位置，考察在两者的作用过程中色氨酸和酪氨酸残基的实际参与情况，应用A.Sulkowska等[18-20]提出的方法，即比较波长在280 nm 和 295 nm 激发时CS-BSA体系荧光程度的降低变化.由图9可知，在波长在280 nm和295 nm激发下，CS对BSA的猝灭程度曲线没有重叠，说明色氨酸和酪氨酸残基都参与其中，对比这2种波长下的荧光猝灭程度可知，在280 nm激发时降低程度更大些，这一现象说明在CS与BSA的结合过程中，结合位点主要位于亚螺旋域ⅡA.

2.7 药物协同性

BSA具有多重结合部位，药物与BSA结合时，BSA各结合部位之间存在相互影响作用，这种相互影响作用称为药物的协同作用，可用Hill方程[18-20]进行分析：lgD/(1-D)=lgKH+nHlg[C]，其中H为结合饱和分数，KH为结合常数，nH为Hill系数.在荧光实验中：D/(1-D)=B/(Bm-B)，其中B=(F0-F)/F0；1/Bm是1/B对1/[C]作图的截距.CS-BSA的nH值的计算结果见表5.由表5可知，3个温度下的nH都大于1，表现为正协同作用，说明CS与BSA结合过程中，随着配体CS不断地结合到位点，使得后继配体对BSA的亲和性增加，即前一个药物分子结合到BSA位点上后，对后一个药物分子与BSA的结合起到促进作用.随着温度的变化，虽然nH变化不大，但也随温度升高而降低，说明温度的提升对CS药物小分子之间的协同作用不利.

图9 λex为 280 nm 和 295 nm 时，CS-BSA的荧光猝灭曲线

表5 不同温度下的nH值

2.8 CS对BSA构象的影响

蛋白质的构象变化通常用同步荧光光谱来分析，根据λem的变化来确定其荧光猝灭主要由何种氨基酸残基起主导作用，而且氨基酸残基的λem移动方向与其所处的疏水性也紧密相关.Δλ=60 nm和Δλ=15 nm分别显示色氨酸和酪氨酸残基的荧光特征.在Δλ=15 nm和Δλ=60 nm条件下测CS加入BSA之后的同步荧光光谱见图10.由图10可知，随CS浓度的增大，这2种氨基酸残基的λem几乎没有发生移动，说明CS的加入不改变BSA的构象.酪氨酸的猝灭程度大于色氨酸，表明CS与BSA相结合的位点偏向于酪氨酸.

c(BSA)= 7.5×10-6 mol·L-1,c(CS)=(0、1、1.5、2、2.5、3、3,5、4、4.5、5、5.5、6、6.5) ×10-5 mol·L-1.

3 结论

用荧光和紫外光谱法推断CS对BSA荧光产生静态猝灭，CS和BSA之间的作用力类型主要为静电作用力.测得287 K、301 K和311 K的Kb、n和nH.CS与BSA可形成一个结合位点，表明CS可被BSA运输.nH>1，表明CS对结合反应产生正协同作用，即CS加入使BSA的亲和性增强，有利于后续CS与BSA的结合.结合部位在BSA的亚螺旋域ⅡA中.同步荧光光谱表明CS几乎不对BSA构象产生影响，结合位点靠近酪氨酸残基.该研究结果为了解CS在体内的运输和代谢过程、毒性机制提供了重要信息.

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(责任编辑：刘显亮)

TheStudyonInteractionbetweenCeftezoleSodiumandBovineSerumAlbuminbySpectrometry

LIU Li,CHENG Fei-xiang
(College of Chemistry and Chemical Engineering,Qujing Normal University，Qujing Yunnan 655011，China)

Under the optimal conditions，the interaction of ceftezole sodium (CS) with bovine serum albumin(BSA) was investigated by fluorescence spectrometry and ultraviolet-visible light absorption spectrometry.The experiments demonstrated that the CS quenched the intrinsic fluorescence of BSA by forming CS-BSA complex.The mechanism of the fluorescence quench was static quenching.The binding constants and the numbers of binding site at different temperatures were calculated.The main binding forces were concluded as electrostatic forces from the calculated values of the thermodynamic parameter.The process of binding was spontaneous because that Gibbs free energy change was negative.The primary binding site for CS was located at sub-domain ⅡA of BSA.The values of Hill's coefficients were more than 1,which indicated that there was some positive cooperative effect.The effect of CS on the conformation of BSA was also studied by using synchronous fluorescence spectroscopy.Studies utilizing synchronous spectra showed that the conjugation reaction between CS and BSA would not affect the conformation of BSA.Synchronous fluorescence indicated that the binding site of CS and BSA was near by tyrosine residue.

ceftezole sodium;fluorescence quenching;interaction

2014-10-03

国家自然科学基金(21261019)资助项目.

刘 里(1982-)，女，满族，吉林省吉林市人，讲师，主要从事药物化学和分子发光学理论与应用研究.

1000-5862(2014)06-0639-06

O 657.3

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