骨髓增殖性肿瘤治疗药物TG101348的合成工艺研究

张义军,刘义稳,李德江

(1.三峡大学生物与制药学院，湖北 宜昌 443002;2.三峡大学材料与化工学院,湖北 宜昌 443002)



骨髓增殖性肿瘤治疗药物TG101348的合成工艺研究

张义军1,刘义稳1,李德江2*

(1.三峡大学生物与制药学院，湖北 宜昌 443002;
2.三峡大学材料与化工学院,湖北 宜昌 443002)

研究了骨髓增殖性肿瘤治疗药物TG101348的合成工艺.将2,4-二羟基-5-甲基嘧啶与三氯氧磷、氨水发生氯化、取代反应生成2-氯-4-氨基-5-甲基嘧啶(Ⅲ)，而后Ⅲ与N-叔丁基-3-溴苯磺酰胺(Ⅰ)发生Buchwald偶联反应得到3-[(2-氯-5-甲基-4-嘧啶基)胺基]-N-(叔丁基)苯磺酰胺(Ⅳ)，Ⅳ再与CH3OH-HCl反应得到3-[(2-氯-5-甲基-4-嘧啶基)胺基]-N-(叔丁基)苯磺酰胺盐酸盐(Ⅴ),最后Ⅴ与1-(4-氨基苯氧乙基)吡咯烷(Ⅵ)发生亲核取代反应得到TG101348，HPLC测得TG101348的纯度为99.7%.

TG101348;合成;工艺研究

0 引言

骨髓增殖性肿瘤疾病是一类起源于多能造血肝细胞，以骨髓中髓系细胞增生异常为特点的异质性疾病.通常发病的表现形式包括慢性髓细胞白血病(polycythemia vera)、原发性骨髓纤维化(myelofibrosis)、血小板增多症(essential thrombocytosis)等.过去10年国际上的研究结果表明，细胞内酪氨酸蛋白酶(PTK)上的JAK2V617F基因突变引起信号传播途径JAK-STAT的过度活化，这是导致这类疾病发生的原因[1-5].N-叔丁基-3-[5-甲基-2-[[4-[2-(1-吡咯烷基)乙氧基]苯基]氨基]-4-氨基嘧啶]苯磺酰胺(TG101348)是由美国Targe Gen公司、哈佛医学院和明尼苏达的Mayo医务所等单位联合开发的JAK2蛋白激酶的选择性抑制剂，临床前的真性红细胞内和细胞外的实验显示，它可以选择性地抑制导致骨髓增生性疾病的JAK2基因的V617F和MPLW515L突变.具有治疗真性红细胞增多症(polycythemia vera，PV)、原发性血小板增多症(essential thrombocythemia，ET)、原发性骨髓纤维化(primary myelofibrosis，PMF)等疾病的活性[6-11].目前TG101348的合成路线主要是美国Targe Gen公司申请的专利[12]WO2007/053452A1，该专利合成方法是利用化合物2-氯-4-氨基-5-甲基嘧啶和1-(4-氨基苯氧乙基)吡咯烷进行反应，再与化合物N-叔丁基-3溴苯磺酰胺在金属钯的催化下进行偶联得到目标产物TG101348.该合成方法进行偶联反应需要价格昂贵的金属钯试剂和磷配体进行催化，且采用微波加热，因此不利于工业化生产.

通过对TG101348的合成研究，本课题组提出了以2,4-二羟基-5-甲基嘧啶为原料制备TG101348的完整的中试合成方法，且对TG101348的合成作了如下改进：(i)合成1-(4-氨基苯氧乙基)吡咯烷(中间体Ⅵ)，不需分离、纯化，直接用于下一步反应；(ii)合成3-[(2-氯-5-甲基-4-嘧啶基)胺基]-N-(叔丁基)苯磺酰胺(中间体Ⅳ)，使用磷酸钾代替价格昂贵的碳酸铯，且钯催化剂的用量只为原专利的3%；(iii)通过改变偶联次序，将Buchwald偶联反应的收率提高了23%，将关键中间体Ⅳ成盐活化成Ⅴ，Ⅴ与Ⅵ反应以84.3%的收率合成TG101348.合成路线见Scheme 1.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

熔点测定采用WRS-1A型数字熔点仪(上海索光光电技术有限公司)，温度计未校正；1H NMR测定采用AVANCE III 400MHz核磁共振波谱仪(瑞士Bruker公司)，TMS为内标； MS使用AmozonSL+1200型ESI-MS电喷雾质谱仪测定.

本实验所用原料均由上海恒岳化工科技有限公司提供，纯度为分析纯.

Scheme 1 合成路线

1.2 合成步骤

1.2.1N-叔丁基-3溴苯磺酰胺(Ⅰ)的合成 将3.140 g叔丁胺(43.000 mmol)和5.940 g三乙胺(58.600 mmol)溶解在20 mL二氯甲烷中，搅拌下缓慢加入装有10.000 g(39.100 mmol)3-溴苯磺酰氯100 mL的烧瓶中，在室温下反应.反应完成后，反应液经减压浓缩，并加入20 mL 质量分数为15%的HCl溶液及25 mL乙酸乙酯萃取有机相，有机相依次用水、饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥.滤除硫酸钠后，减压浓缩有机液，得到白色固体N-叔丁基-3-溴苯磺酰胺(Ⅰ)10.200 g，收率89.7%.熔点：67～69 ℃.1H NMR (400MHz,DMSO-d6):7.979(s,1H),7.84～7.81(m,2H),7.697(s,1H),7.545(m,1H),1.106(s,9H).ESI-MS (m/z):291.7(M++H).

1.2.2 2,4-二氯-5-甲基嘧啶(Ⅱ)的合成 在100 mL的烧瓶中，加入5.000 g(3.960 mmol)2,4-二羟基-5-甲基嘧啶、30 mL新蒸的三氯氧磷.搅拌，回流反应3.0 h，TLC跟踪反应进程.反应完成后，加入到100 mL冰水中.过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，有机相经干燥、减压浓缩得化合物Ⅱ，白色固体，4.000 g，收率65.2%.熔点：25～27 ℃.1H NMR(400MHz,CDCl3):8.441(s,1H),2.374(s,3H)；ESI-MS (m/z):162.9(M++H).

1.2.3 2-氯-5-甲基-6-胺基嘧啶(Ⅲ)的合成 在封管反应器中依次加入5.000 g(30.670 mmol)化合物Ⅱ、20 mL四氢呋喃，再加入20 mL质量分数为25%的氨水.封管后，搅拌下加热到60 ℃，并在该反应温度下反应12.0 h.TLC跟踪反应进程.反应完成后，反应液冷却至室温，减压浓缩得化合物Ⅲ，白色固体，4.000 g，产率91%.熔点：246～248 ℃.1H NMR (400MHz,DMSO-d6):7.28(s,1H),7.04～7.30(brs,2H),1.94(s,3H).ESI-MS (m/z):144.0(M++H).

1.2.4 3-[(2-氯-5-甲基-4-嘧啶基)胺基]-N-(叔丁基)苯磺酰胺(Ⅳ)的合成 在500 mL的烧瓶中，加入3.000 g(20.900 mmol)化合物Ⅲ、6.360 g(21.770 mmol)化合物Ⅰ、8.870 g (41.800 mmol)磷酸钾、210 mL二氧六环，在搅拌下，再滴加0.714 g(1.254 mmol) 4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽(Xantphos)、0.573 g (0.627 mmol)Pd2(dba)3([1,1′-双(二苯基磷)二茂铁]二氯化钯).在室温搅拌下，反应体系用氮气置换3次，逐渐升温至100 ℃，保温反应6.0 h.待LC-MS检测反应原料消失，将反应液自然冷却至室温，硅藻土过滤，滤饼用适量二氧六环洗涤2次，滤液浓缩，得粗品.将粗品分散于10 mL乙酸乙酯中，室温搅拌1.0 h后过滤，滤饼用少量乙酸乙酯洗涤2次，固体真空干燥，得化合物Ⅳ 6.150 g，收率90.3%，熔点216～218 ℃.1H NMR (400MHz,DMSO-d6):9.143(s,1H),7.889～8.111(m,3H),7.551～7.564(m,3H),2.199(s,3H),1.139(s,9H);ESI-MS (m/z):355.0(M++H).

1.2.5 3-[(2-氯-5-甲基-4-嘧啶基)胺基]-N-(叔丁基)苯磺酰胺盐酸盐(Ⅴ)的合成 在100 mL的烧瓶中，加入2.300 g(6.480 mmol)化合物Ⅳ和40 mL甲醇，再缓慢滴入新制备的CH3OH-HCl溶液中，室温反应0.5 h，待固体完全溶解后减压浓缩蒸出溶剂，得化合物Ⅴ，黄色固体，2.750 g，产率93.1%.

1.2.6 1-(4-氨基苯氧乙基)吡咯烷(Ⅵ)的合成 在100 mL的烧瓶中，加入1.500 g (13.750 mmol)对氨基苯酚、2.800 g (16.500 mmol) 1-(2-氯乙基)四氢吡咯盐酸盐和30 mL乙腈，搅拌下加入4.560 g(33.000 mmol)K2CO3固体，于85 ℃下反应2.0 h，反应结束后，过滤，滤饼用10 mL二氯甲烷洗涤2次，合并有机相.用50 mL饱和氯化钠洗涤有机液，有机相经干燥、浓缩得粗品.粗品经柱层析纯化(CH3COOCH2CH3∶MeOH=7∶2) 得化合物Ⅵ，棕色油状液体，2.400 g，产率85.2%.1H NMR(400MHz,CDCl3):1.809～1.841(m,4H),2.661～2.675(d,4H,J=5.6 Hz),2.888～2.917(t,2H,J=5.6 Hz),3.437(s,2H),4.042～4.071(t,2H,J=5.6 Hz),6.619～6.641(m,2H),6.733～6.762(m,2H);ESI-MS (m/z):207.3(M++H).

1.2.7N-叔丁基-3-[5-甲基-2-[[4-[2-(1-吡咯烷基)乙氧基]苯基]氨基]-4-氨基嘧啶]苯磺酰胺(TG101348)的合成 将1.000 g (2.330 mmol)化合物Ⅴ和0.485 g (2.330 mmol)化合物Ⅵ依次加入到10 mL的异丙醇中，封管，搅拌下逐渐升温至110 ℃，反应8.0 h.待LC-MS检测反应完全，让反应液自然冷却至室温，过滤，滤饼用少量异丙醇洗涤2次，得盐酸盐产物.将该固体溶解在10 mL水中，加入氨水调节pH值为7，析出大量白色固体，过滤，粗品用异丙醇重结晶，得TG101348，0.950 g，收率84.3%，熔点：243～245 ℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6):6.954～7.951(m,8H),3.405～3.562(m,10H),3.099(s,2H),2.182(s,3H),1.903～2.012(m,4H),1.103(s,9H);ESI-MS (m/z):525.4(M++H).

2 结果和讨论

2.1 Buchwald偶联反应条件的优化

化合物Ⅳ是合成TG101348的关键中间体，本文研究了催化剂、碱以及溶剂对中间体Ⅳ合成工艺的影响，结果如表1所示.

表1 不同的反应条件对中间体Ⅳ收率的影响

由表1可见，以Pd2(dba)3为催化剂，Xantphos为配体，Cs2CO3为碱，甲苯作溶剂，中间体D的收率达到94.1%.但从工业化角度考虑成本、收率等因素，本工艺采用Pd2(dba)3、Xantphos作为催化剂和配体，磷酸钾为碱，二氧六环作为溶剂.

2.2 TG101348合成条件优化

通过实验发现，化合物Ⅳ与化合物Ⅵ反应较慢，将化合物Ⅳ与CH3OH-HCl反应成盐活化生成Ⅴ后与化合物Ⅵ反应，可以加快反应速度，结果如表2所示.

表2 反应时间对TG101348的影响

从表2可以看出，以异丙醇作溶剂，当反应8.0 h时收率最高.

3 结论

1)中间体Ⅳ的合成：使用磷酸钾代替碳酸铯，钯催化剂的用量只为原专利的3%，降低了成本.

2)通过改变偶联次序，将Buchwald偶联反应的收率提高了23%，将关键中间体Ⅳ成盐活化成Ⅴ，Ⅴ与Ⅵ反应以84.3%的收率合成了TG101348.

[1]Tefferi A.JAK inhibitors for myeloproliferative neoplasms:clarifying facts from myths [J].Blood,2012,119(12):2721-2730.

[2] Anand S,Stedham F,Gudqin E,et al.Increased basal intracellular signaling patterns do not correlate with JAK2 genotype in human myeloproliferative neoplasms [J].Blood,2011,118(6):1610-1621.

[3] Well-Knecht K J,Ott G R,Cheng M,et al.2,7-Disubstituted-pyrrolotriazine kinase inhibitors with an unusuallyhigh degree of reactive metabolite formation [J].Chem Res Toxicol,2011,24(11):1994-2003.

[4] Ramakrishnan V,Kimlinger T,Haug J,et al.TG101209,a novel JAK2 inhibitor,has significant in vitro activity in multiple myeloma and displays preferential cytotoxicity for CD451 myeloma cells [J].American Journal of Hematology,2010,85(9):675-686.

[5] Wang Y,Fiskus W,Chong D G,et al.Cotreatment with panobinostat and JAK2 inhibitor TG101209 attenuates JAK2V617F levels and signaling and exerts synergistic cytotoxic effects against human myeloproliferative neoplastic cells [J].Blood,2009,114:5024-5033.

[6] Pardanan A,Hood J,Lasho T,et al.TG101209,a small molecule JAK2-selective kinase inhibitor potently inhibits myeloproliferative disorder-associated JAK2V617F and MPLW515L/K mutations [J].Leukemia,2007,21(8):1658-1668.

[7]李永双，李德江.双-三唑并[3，4-b]-[ 1，3，4]噻二唑类化合物的合成及抗癌活性研究 [J].江西师范大学学报：自然科学版，2012，36(3)：297-300.

[8] 张冰玉，金润铭.JAK2V617F突变及JAK2激酶抑制剂对骨髓增殖性肿瘤的影响 [J].临床血液学杂志，2014,27(9):817-820.

[9]秦伟，梁爱斌，傅建非.JAK2及其抑制剂与骨髓增殖性肿瘤的研究进展 [J].临床血液学杂志，2010,23(11):698-701.

[10] 谢叶香，李金恒，尹笃林.胺作为配体在钯催化偶联反应中的应用 [J].有机化学，2006,26(8):1155-1163.

[11] 张亮，吴劼.金属催化下芳基磺酸酯偶联反应的研究进展 [J].有机化学,2006,26(3):299-309.

[12] Cao Jianguo,Hood J，Sou R,et al.Bi-aryl meta-pyrimidine inhibtors of kinases [P].WO:2007/053452 A1,2007-05-10.

(责任编辑：刘显亮)

TheStudyonaProcessoftheSynthesisBoneMarrowHyperplasticTumortreatmentMedicineTG101348

ZHANG Yi-jun1,LIU Yi-wen1,LI De-jiang2*
(1.College of Biology and Pharmacy,China Three Gorges University,Yichang Hubei 443002,China;
2.College of Materials and Chemical Engineering,China Three Gorges University,Yichang Hubei 443002,China)

The synthetic technique of TG101348 for treating bone marrow hyperplastic tumor was studied.2-chloro-4-amino-5-methyl- pyrimidine(Ⅲ) was prepared by chlorination and substitution reaction of 2,4-dihydroxy-5-methylpyrimidinnel,phosphorus oxychloride and ammonium hydroxide.Ⅲ reacted with 3-bromo-N-t-butyl benzenesulfonic amide(Ⅰ) to give 3-[(2-chloro-5-methyl-4-pyrimidinyl) amino]-N-t-butyl benzenesulfonic amide(Ⅳ) by Buchwald coupling reaction.Ⅳ reacted with CH3OH-HCl to afford 3-[(2-chloro-5-methyl-4-pyrimidinyl) amino]-N-tert-butyl benzenesuiphon amide hydrochloride(Ⅴ).TG101348 was synthesized by nucleophilic substitution reaction of the intermediate Ⅴ and Ⅵ.HPLC purity is 99.7%.

TG101348;synthesis;technical study

2014-06-15

国家自然科学基金(31100080)和湖北省自然科学基金 (2011CDB186)资助项目.

李德江(1964-)，男，湖北郧县人，教授，主要从事精细化工和药物合成研究.

1000-5862(2014)06-0635-04

TQ 463.53

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