pH变化对鲶鱼肌浆蛋白理化和功能特性的影响

李鹏，李沛然，郭耀华，岳兰昕，张乃琳，刘彩虹，马俪珍

（1.天津农学院水产科学系，天津 300384；2.天津农学院动物科学系，天津 300384；3.天津农学院食品科学系，天津 300384）

pH变化对鲶鱼肌浆蛋白理化和功能特性的影响

李鹏1，李沛然2，郭耀华1，岳兰昕2，张乃琳2，刘彩虹2，马俪珍3，*

（1.天津农学院水产科学系，天津 300384；2.天津农学院动物科学系，天津 300384；3.天津农学院食品科学系，天津 300384）

摘 要：提取鲶鱼肉漂洗液中的肌浆蛋白，用酸或碱以5种方式（①pH=3.0→7. 0；②pH=5.0→7. 0；③pH=7.1→7. 0；④pH=9.0→7. 0；⑤pH=11.0→7.0）调节其pH后，研究经过这种pH变化后的肌浆蛋白的蛋白溶解度、表面疏水性、总巯基含量、SDS-PAGE、流变性和热变性等指标的变化，以期为漂洗液中肌浆蛋白的综合利用奠定理论基础。研究结果表明：随着pH向酸性或者碱性的方向逐渐变化，肌浆蛋白溶解度、表面疏水性和总巯基含量不断下降，蛋白氧化加剧，流变学特性（黏度值）和热变性温度不断增加。

关键词：鲶鱼；肌浆蛋白；pH；理化特性；功能特性

鱼体内肌浆蛋白含量占到了全鱼肌肉蛋白的20%～50%，并且肌浆蛋白中包含了一些参与鱼体肌肉能量新陈代谢相关的酶[1]；其中主要有肌酸激酶、醛缩酶和甘油醛-3-磷酸盐脱氢酶[2]。然而人们长时间以来认为肌浆蛋白会影响肌原纤维蛋白的凝胶性，因此在鱼肉产品生产中，为生产成为“鱼糜（肌原纤维蛋白的集中产物）”，大量的肌浆蛋白在漂洗过程中会被去除，以便后期更好的加工和贮藏。据研究发现，在鱼糜生产加工中，每生产100 kg的鱼糜，将会产生50 kg的肌浆蛋白[3]。因此，找到一条切实可行的肌浆蛋白利用方法是至关重要的，这不仅能降低废水处理的负荷，而且能够有效地利用鱼类资源。

近年来，有关肌浆蛋白可以提高鱼糜的凝胶效果研究被广泛涉及。沙丁鱼肌浆蛋白通过硫酸铵分级处理可以增加沙丁鱼鱼糜的存储模量[3]。添加了罗非鱼肌浆蛋白的蜥鱼鱼糜制得的凝胶，其凝胶强度有所提高[4]。主要原因是肌浆蛋白中含有一定量的具有一定活力的谷氨酰胺转氨酶（TGase）[5]。肌浆蛋白除能增强鱼糜的凝胶性以外，其他的有关肌浆蛋白的功能特性研究报道很少。Krasaechol（2008）等研究发现通过化学修饰，如乙酰化作用和胰蛋白酶修饰增加了金线鱼肌浆蛋白的乳化性和起泡性[5]。尽管化学修饰可以改善一些食品蛋白的功能特性，但这些方法并没有广泛应用于食品行业。

当蛋白质遭受极酸性或极碱性处理时，其随后会发生构象变化，影响其功能性质[6]。当鱼肉蛋白处于一定的pH变化范围内时，其凝胶特性会相应提高[7]。在这个过程中，肌肉蛋白质首先对其进行极酸性或极碱性pH处理，此时蛋白具可溶性，随后将其恢复到等电点（pH约为5.5）从而产生沉淀[7]。pH变化导致了肌浆球蛋白重链的部分伸展和重新折叠，导致肌球蛋白融化形成球体状态；当肌浆球蛋白在酸和碱的环境下溶解，之后将混合物中和至pH7.5时，使其表面疏水基团暴露和伸展，从而导致其表面界面活力增加，乳化能力提高[6]。因此，pH变化可以一定程度地改善肌浆蛋白功能特性。本试验旨在研究不同梯度pH对肌浆蛋白各项理化及功能特性的影响，从而为肌浆蛋白在食品中的应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

鲶鱼（Clarias gariepinus）：体重（1±0.2）kg，体长（37±3）cm，2013年10月购于天津市西青区红旗农贸市场。

1 mol/L 的 HCl，1 mol/L 的 NaOH，溴酚蓝，考马斯亮蓝R-250，聚丙烯酰胺，过硫酸铵，甘油，尿素，Tris-HCl，酒石酸钾钠等均为分析纯。

1.2 仪器

酸度计（PB-10）：赛多利斯科学仪器有限公司；高速剪切分散乳化机（FA25）：德国弗鲁克公司；紫外分光光度计（UV-1800）：日本岛津公司；流变仪（R/S+）：美国Brookfield公司；差示扫描量热仪（DSC200F3）：德国耐驰；冷冻离心机（ST40R）：德国Theromo Scientific；电泳仪（MINI 4）：美国伯乐（Bio-Rad）公司。

1.3 方法

1.3.1 鲶鱼肌浆蛋白的制备

鲶鱼经宰杀后采肉、绞碎，在碎肉中添加3倍体积的蒸馏水（4℃）匀浆（高速剪切乳化分散机，B档），然后5 500 r/min离心20 min（4℃），上清液用两层纱布过滤，得到鲶鱼肌浆蛋白（CL-SP）。

1.3.2 pH处理

制得的CL-SP初始pH为7.1，分别用1 mol/L的HCl或1 mol/L的NaOH调整CL-SP的pH为3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，搅拌均匀后随即将各溶液的pH再调整回7.0。

1.3.3 蛋白溶解度的测定

将CL-SP在4℃，5 500 r/min离心20 min，利用双缩脲法测定其上清液中的蛋白含量。蛋白溶解度测定结果表示为每毫升上清液中肌浆蛋白的毫克数，即单位为mg/mL。

1.3.4 表面疏水性的测定

表面疏水性的测定依据Chelh（2006）的方法[8]。将肌浆蛋白溶于pH 7.0，20 mmol/L的磷酸盐缓冲溶液中，肌浆蛋白浓度为5 mg/mL。取1 mL加入200 μL的溴酚蓝（BPB，1 mg/mL）混匀，室温下揽拌10 min，然后7500r/min离心15min，上清液（稀释10倍后）在595nm下测定吸收值A。空白样用1 mL pH 7.0，20 mmol/L的磷酸盐缓冲液加200 μL BPB，磷酸盐缓冲液作空白样。表面疏水性计算公式为：

1.3.5 总巯基含量的测定

巯基含量的测定参考Ellman的方法[9]。

1.3.6 流变学测定

采用R/S+型流变仪，选择50 mm，1°的锥转子（CC40）流变测量系统，测定流变特性。测定：剪切率从0 s-1增加到100 s-1，再从100 s-1减小到0 s-1，完成一次循环，测定CL-SP黏度随剪切率的变化。

1.3.7 SDS-PAGE

SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）参考Laemmli的方法[10]。

1.3.8 热变性温度的测定

测定采用差示扫描量热法，称取样品5 mg～15 mg，密封在铝盒中并放入样品池，以空盒做参比，保护气为氮气，升温速率8℃/min，温度范围10℃～120℃。

1.3.9 数据处理

实验重复两次，每次取样是3个平行样品进行数据测定。数据分析采用Statistix 8.1软件包中Linear Models程序进行，使用Turkey test程序进行差异显著性（P＜0.05）分析。绘图软件采用SigmaPlot 10.0。

2 结果与讨论

2.1 酸碱处理对CL-SP蛋白溶解度的影响

蛋白溶解度是评价蛋白功能特性的重要指标，经不同酸碱处理后的CL-SP蛋白溶解度变化如图1所示。

图1 酸碱处理后鲶鱼肌浆蛋白蛋白溶解度的变化Fig.1 Protein solubility of CL-SP subjected to various pH treatments

CL-SP的未处理组蛋白溶解度为10.36 mg/mL，经过不同的酸碱处理后，其蛋白溶解度均表现为不同程度的降低，其中pH为3.0→7.0和pH为11.0→7.0的处理组蛋白溶解度降低最为明显，分别降至3.14 mg/mL和7.95 mg/mL，与未处理组差异显著（P<0.05）。其余三组中，pH为7.1→7.0组的蛋白溶解性变化不明显（P<0.05），pH为5.0→7.0和pH为9.0→7.0的蛋白溶解度变化与对照组差异亦达显著水平（P<0.05）。造成蛋白溶解度下降的主要原因是因为酸碱处理导致蛋白在等电点处沉淀，且极端的pH会导致肌浆蛋白分子展开。这一研究结果与Jirawat（2010）等的研究报道相一致，Jirawat（2010）研究发现，酸碱处理金线鱼肌浆蛋白后，pH为3和pH为12时其蛋白分子片段展开，导致溶解度下降。当重新调回pH为7时，蛋白分子进行了重新折叠和聚合，进一步导致蛋白溶解度的降低[11]。

2.2 酸碱处理对CL-SP表面疏水性的影响

酸碱处理CL-SP后其表面疏水性的变化如图2所示。

图2 酸碱处理后鲶鱼肌浆蛋白表面疏水性的变化Fig.2 Surface hydrophobicity of CL-SP subjected to various pH treatments

对照组pH和pH为7.1→7的处理组其溴酚蓝含量（81.0 μg 和 81.49 μg）最高，其对应的表面疏水性最强，经过酸碱处理后pH=3.0→7.0和pH=11.0→7.0处理组下降最多，含量分别为47.50 μg和45.43 μg。当肌浆蛋白遭受极端pH（pH=3和pH=11）处理时，蛋白结构发生伸展，并且在中和反应过程中不断促进疏水相互作用，结果导致表面疏水性含量明显下降。Jirawat.Y.和Bung-orn.H.（2010）在研究pH对金线鱼肌浆蛋白结构影响中指出，经傅里叶红外光谱扫描pH=12时其蛋白伸展和聚合程度要高于pH=9[11]。Gratacos-Cubarsi和Lametsch（2008）报道指出，随着pH环境的加剧，部分肌浆蛋白（例如肌酐酸激酶M、醛缩酶A抗体和乳酸脱氢酶）含量上升。在调整pH至蛋白等电点时，导致了蛋白构象上的改变，也是表面疏水性下降的原因[14]。

2.3 酸碱处理对CL-SP巯基含量变化的影响

不同酸碱处理CL-SP后的巯基含量变化如图3所示。

图3 酸碱处理后鲶鱼肌浆蛋白总巯基含量的变化Fig.3 Total sulfydryl content of CL-SP subjected to various pH treatments

相比较而言巯基含量在pH为7.1→7.0组最高（49.29 nmol/mg蛋白），与对照组没有差异（P<0.05），随着pH向酸性或者碱性的逐渐变化，SH含量逐渐下降，在pH为3.0→7.0和pH为11.0→7.0组时巯基含量分别降为24.72 nmol/mg蛋白和35.93 nmol/mg蛋白（P<0.05）。结果表明在进行酸碱处理时肌浆蛋白巯基发生了氧化，且处理越剧烈，氧化程度越强。此结果与Thawornchinsombut和 Park（2004）在研究太平洋鳕鱼鱼肉时发现pH为4和pH为10时蛋白总巯基含量低于pH为7的结果一致[12]。在酸碱处理过程中，肌浆蛋白构象上的改变结果使SH的暴露，导致二硫键的形成，从而降低巯基含量。同时等电点沉淀和后期的中和反应都会影响总巯基含量的变化[13]。

2.4 酸碱处理对CL-SP流变学特性的影响

图4反映了5组酸碱处理CL-SP后在4℃下的流变学特性变化。

图4 酸碱处理后鲶鱼肌浆蛋白流变学特性的变化Fig.4 Rheological property of CL-SP subjected to various pH treatments

由图4可以看出，所有处理其流变学特性均发生了显著性变化，呈现“假塑形”；最初黏度值最高，随着剪切率的升高，其黏度值不断下降，黏度降幅之间差异逐渐减小，最终趋于0 Pa*s。同时随着pH向酸性或者碱性的方向逐渐变化，其最高黏度值不断升高，相比较 pH=7.1→7.0（8.174 9 Pa*s）组，pH 为 3.0→7.0 和pH为11.0→7.0处理组，其黏度值达到最高值（12.676 9 Pa*s和12.242 2 Pa*s）。在酸碱处理和中和反应的过程中，蛋白发生伸展和聚合，形成一定量的沉淀蛋白分散于蛋白样品中，从而在流变过程中产生相应的阻力，所以黏度逐渐升高。

2.5SDS-PAGE

蛋白质氧化的主要表现之一是蛋白聚集，在某些情况下，形成蛋白片段[14]。图5为不同pH处理组的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

由图5可以看出肌浆蛋白在分子量116 ku～200 ku时，pH为3.0→7.0和pH为11.0→7.0处理组条带深度弱于其他三个处理组。这种情况相应的在其他分子量（66 ku～97 ku、46 ku～66 ku、21 ku～46 ku） 时也有发生，且pH为3.0→7.0处理组表现的尤为明显。然而其他三组处理（pH为5.0→7.0、pH为7.1→7.0和pH为9.0→7.0）之间差异不显著。这一结果的主要原因是极端pH诱发大量的蛋白分子结构伸展，蛋白分子之间发生聚合，从而导致蛋白溶解度降低。这与Jirawat和Bung-orn（2010）的研究结果一致[11]；同时从图 3中可以看出在酸碱处理过程中，随着pH向酸性或者碱性的方向逐渐变化，肌浆蛋白总巯基含量下降，氧化程度提高，在处理过程中蛋白发生了交联聚合以及蛋白降解。

图5 酸碱处理后鲶鱼肌浆蛋白SDS-PAGE情况Fig.5 SDS-PAGE of CL-SP subjected to various pH treatments

2.6 pH变化和冻干处理对CL-SP热变性温度的影响

蛋白质的热变性过程可以看作是温度的动态函数。蛋白质在热变性过程中，吸收热量时由一个有序状态变为无序状态，分子内相互作用被破坏，多肽链展开。当达到蛋白质的变性温度时，在热分析图谱上会出现一个吸热峰[15]。

图6 酸碱处理后鲶鱼肌浆蛋白热变性的变化Fig.6 The change of thermal denaturation of CL-SP subjected to various pH treatments.

由图6可以看出所有处理组都有一个主要的吸收峰，代表了CL-SP的热变性温度点。随着pH向酸性或者碱性的方向逐渐变化，热变性温度值由59.16℃（pH为7.1→7.0处理组）逐渐升高至88.97℃（pH为3.0→7.0处理组）和 86.08℃（pH为11.0→7.0处理组）。在肌浆蛋白为对照组和pH为7.1→7.0处理组时，表面基本不带电荷，这样致使蛋白在较低的温度下就会热变性。当pH在调整到极端酸碱环境的过程中（如3.0→7.0和11.0→7.0），蛋白表面携带了越来越多的电荷，因此需要更高的温度去克服静电作用力和诱发蛋白和蛋白之间的相互作用。研究结果表明，肌浆蛋白的聚合变性很大程度上取决于其pH的变化[16]。

3 结论

鲶鱼肌浆蛋白（CL-SP）在通过不同酸碱处理后，其蛋白氧化水平、流变学特性和热变性都发生了不同程度的变化。相对于初始pH环境下的CL-SP，随着pH向酸性或者碱性的方向逐渐变化，肌浆蛋白的蛋白溶解度、表面疏水性和巯基含量显著下降（P<0.05），pH=3.0→7.0和pH=11.0→7.0处理组分别降为最低值，且从电泳图谱可以看出氧化水平不断加剧；CL-SP处理组流变性和热变性方面，随着pH向酸性或者碱性的方向逐渐变化，黏度值和热变性温度不断上升。

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Physicochemical and Functional Characteristics Changes of Catfish Sarcoplasmic Proteins Subjected to pH-Shift Method

LI Peng1，LI Pei-ran2，GUO Yao-hua1，YUE Lan-xin2，ZHANG Nai-lin2，LIU Cai-hong2，MA Li-zhen3，*
（1.The Department of Aquatic Science of Tianjin Agriculture University，Tianjin 300384，China；2.The Department of Animal Science of Tianjin Agriculture University，Tianjin 300384，China；3.The Department of Food Science of Tianjin Agriculture University，Tianjin 300384，China）

Abstract：This paper used the sarcoplasmic protein of washing water from catfish （Clarias gariepinus）， and subjected to pH-shift method （pH=3.0→7.0，pH=5.0→7.0，pH=7.1→7.0，pH=9.0→7.0，pH=11.0→7.0）as the research object.Each treatment group was analyzed by protein solubility，surface hydrophobicity，total sulfhydryl content， SDS-PAGE， rheological property and the change of thermal denaturation.Results showed， as the environment of pH to the direction of the acidic or alkaline，sarcoplasm protein solubility，surface hydrophobicity and total sulfydryl content had decreased， protein oxiution increased， meanwhile， rheological properties（viscosity） and thermal denaturation temperature improved.

Key words：catfish （Clarias gariepinus）；sarcoplasmic protein；pH；physicochemical properties；functional characteristics

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2014.06.002

天津市科委科技支撑项目“淡水鱼鱼糜安全及品质控制和副产物高值化利用关键技术研究与工程示范（项目编号：13ZCZDNC01600）”

李鹏（1988—），男（汉），研究生，研究方向：水产品质量与安全。

马俪珍（1963—），女（汉），教授，研究方向：畜产和水产加工技术。

2013-12-30