不同腧穴组方对高脂血症大鼠肝脏形态学影响的观察

苗晋玲，张国鑫，张中原，冀来喜

（1.山西中医学院，山西太原030024； 2.天津中医药大学针灸推拿学院，天津300193）

高脂血症（hyperlipidemia）是由于脂肪代谢或运转异常使血浆中一种或几种脂质高于正常的一类常见疾病，是人体内脂质代谢紊乱的结果，是动脉粥样硬化和脂肪肝发病的重要危险因素［1］。脂肪性肝病是因甘油三酯（TG）在肝脏过度沉积而导致的临床病理综合征。随着人们生活方式及饮食习惯的变化，高脂血症并发脂肪肝的发病率不断升高，且发病年龄日趋提前［2］。据统计，我国高脂血症的发病率为18.6%，全国血脂异常人数约1.6亿，脂肪肝平均发病率25%，成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病。因此，防治高脂血症合并脂肪肝有着重要的临床价值。针灸作为一种有效的治疗方法，以操作简便，疗效确切，毒副作用少而更具独特的优势。

通过观察高脂血症并发脂肪肝大鼠针刺“丰隆、中脘、曲池”穴不同组合后肝脏的形态学变化，进而探讨最佳腧穴组方治疗高脂血症并发脂肪肝的疗效及初步机制，以便为临床提供更多的理论和实验指导。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物与分组 雄性SD大鼠90只（购于北京海淀兴旺实验动物养殖场），体重（70±10）g，普通饲料喂养1 w后，将大鼠随机分为空白组10只（A组），模型组80只，空白组喂养普通饲料，模型组喂养高脂固体饲料（2.0%胆固醇，10.0%猪油，0.2%丙基硫氧嘧啶，基础饲料87.8%）复制高脂血症脂肪肝大鼠模型。自由喂养，饮水不限。动物房温度和湿度分别维持在23℃和60%左右。饲养3 w后，隔夜禁食，所有大鼠眼眶静脉采血，检测胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白及谷氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶值，观察血脂、肝功指标是否升高。造模成功后，从第4周将模型组大鼠随机分为模型对照组 10只（B组），曲池组（C组），中脘组（D组），丰隆组（E组），曲池+中脘组（F组），曲池+丰隆组（G组），中脘+丰隆组（H组），曲池+中脘+丰隆组（I组），每组10只。

1.1.2 试剂与仪器 TG、TC试剂盒，AST、ALT试剂盒（太原奥盛源科贸有限公司）；电子秤（太原市小店区体坛生化试剂商行），毫针（汉医无菌针），电针仪、离心机、生物显微镜等设备以及生化分析、图像分析均由山西医科大学提供。

1.2 实验方法

1.2.1 针刺方法 造模成功后，模型对照组大鼠抓取固定，不做针刺。电针治疗组大鼠均固定于大鼠固定器中，采用32号1寸汉医一次性针灸针，取穴参照华兴邦动物穴位图谱，分别取“曲池”、“丰隆”、“中脘”，针刺后接通电针治疗仪，避免同一条导线分接身体两侧。频率10 Hz，强度1.5 V连续波刺激，以肢体轻微抖动为宜。1次/d，20 min/次，连续治疗4 w。1.2.2 观察指标 治疗期间，每日观察并记录各组大鼠的整体精神状态、活动度、毛色、粪便等变化。实验7 w后，禁食12 h，10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，分离血清，分别检测甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、谷氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST），由山西中医学院附属医院检验科完成。取肝脏左叶，肉眼观察各组肝脏颜色、体积、包膜及切面有无异常变化。截取肝脏左叶1 cm×1 cm×1 cm组织1块，置于10%福尔马林固定，逐级酒精脱水，石蜡包埋，常规切片，HE染色，光镜观察肝脏细胞变化。

1.3 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件数据分析，所有数据资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

实验过程中，与正常组大鼠相比，模型组大鼠毛色由亮白色变为乳白色，毛发干，食量减少，大便减少，对外界刺激的反应较迟钝。

2.2 各组大鼠干预4 w后血脂比较

与A组比较，B组大鼠血清TC、TG、LDL-C明显升高，HDL-C降低（P<0.01），说明造模成功，模型表现为高血脂状态。与B组比较，除C组外其余各针刺组 TC均显著降低（P<0.05，P<0.01）；I组 TG 明显降低（P<0.05），其余针刺各组均有降低趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）；针刺各组HDL-C均显著升高，LDL-C均明显降低（P<0.05或P<0.01）。

TC、TG、LDL-C变化各针刺组间比较差异均无统计学意义（P>0.05），针刺各组降低 TC、TG、LDL-C趋势的效果为I>H>G>F>E>D>C；针刺各组HDL-C有递增趋势，但各组间比较差异均无统计学意义（P>0.05），其增高HDL-C的效果为C

表1 各组大鼠干预4 w后血脂比较 （mmol/L，±s）

表1 各组大鼠干预4 w后血脂比较 （mmol/L，±s）

注：与 A 组比较，1）P<0.01；与 B 组比较，2）P<0.05，3）P<0.01

组别 TC TG HDL-C LDL-C A 组 1.58±0.180.35±0.111.00±0.130.50±0.09 B 组 1.78±0.121） 0.57±0.211） 0.82±0.111） 0.79±0.111）C 组 1.67±0.130.43±0.140.41±0.112） 0.62±0.113）D 组 1.63±0.162） 0.42±0.080.44±0.082） 0.59±0.183）E 组 1.48±0.163） 0.42±0.070.46±0.142） 0.58±0.183）F 组 1.43±0.563） 0.41±0.090.49±0.112） 0.54±0.173）G 组 1.40±0.113） 0.41±0.110.49±0.932） 0.54±0.123）H 组 1.33±0.103） 0.38±0.120.53±0.122） 0.53±0.133）I 组 1.29±0.193） 0.37±0.092） 0.69±0.103） 0.47±0.153）

2.3 各组大鼠干预7 w后谷氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶含量的比较

结果见表2。

表2 各组大鼠干预7 w后ALT、AST含量的比较 （mmol/L，±s）

表2 各组大鼠干预7 w后ALT、AST含量的比较 （mmol/L，±s）

注：与 B 组比较，1）P<0.05

组别 n ALT AST A 组 1058.51±5.411） 155.42±7.95 B 组 1073.82±12.32132.98±19.8 C 组 1077.30±8.15159.50±10.02 D 组 1077.45±5.80169.53±11.71 E 组 1069.21±9.60147.78±8.62 F 组 1075.31±10.07138.17±8.37 G 组 1075.86±10.32138.14±16.71 H 组 1075.61±6.68127.28±17.29 I 组 1065.32±13.121） 121.86±13.581）

由表2可见，食用高脂饲料后大鼠血清中的转氨酶明显升高，B组较A组ALT升高明显，电针不同腧穴组合治疗7 w后，I组ALT、AST较B组显著下降（P<0.05）。

2.4 肝脏组织形态学变化

各大鼠肝脏组织解剖后，A组肝脏外观呈暗红色，质地柔软，弹性好。B组肝脏均不同程度发黄，有油腻感，体积增大，边缘圆钝，有的与周围组织粘连（结果见图1）。A组肝小叶结构完整清晰，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝小叶肝细胞分界清晰，胞核圆，位于细胞中央，胞质丰富，肝窦中枯否细胞清晰可见。B组肝索排列紊乱，肝细胞肿胀，呈中-重度脂肪变，均可见到小叶内炎症，炎症细胞主要以单个核细胞为主，肝细胞出现大小不等的脂肪滴，以大泡型脂肪滴为主，部分肝细胞核被脂肪滴挤压而明显偏位，未见纤维化。C～E组肝小叶结构清晰度差，肝索放射状排列不齐，部分肝细胞体积增大，在中央静脉及汇管区周边脂变程度较轻，汇管区可见炎性细胞浸润，偶见肝细胞坏死灶。F～H组肝小叶结构基本完整清晰，肝索放射状排列基本整齐，偶见炎性细胞浸润。I组肝小叶和肝窦结构清晰，细胞内脂滴数量减少，体积缩小（结果见图2）。

图1 肝脏肉眼观察图

图2 各组大鼠肝脏光镜观察图（HE染色，10×40）

3 讨论

高脂血症并发脂肪肝，是一种临床常见的脂代谢紊乱及肝功异常的疾病。近年来，随着经济的发展，人们生活水平的提高及膳食结构的改变，导致体力活动减少，肥胖比例上升，高脂血症并发脂肪肝发病率呈现出持续升高的趋势。

目前国内外研究肝脏代谢、脂质代谢过程中多使用大鼠，它具有价格相对低、生产周期短、易于饲养管理、抵抗力强、实验取材可满足大量指标的检测等特点，被广泛用于高脂血症研究的模型动物［3］。高脂血症脂肪肝大鼠的造模及治疗方法很多，但其机理一致，均通过直接给动物喂饲含有高胆固醇、高甘油三酯的高脂食饵引起动物脂代谢紊乱，从而使动物血清中的转氨酶和甘油三酯升高［4］。再通过针刺不同腧穴治疗，如周利等［5］电针“丰隆”穴与普伐他汀钠组比较，发现两组均对高脂血症大鼠TC、TG、LDL-C、NO以及CGRP具有较好的良性调节作用。谢凯等［6］将强刺激针刺与常规针刺治疗进行比较，结果发现两者均可降低血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG），升高HDL-C，其中以强刺激针法的总胆固醇水平与治疗前相比较降幅最大。夏棣其等［7］认为电针具有保护肝细胞、减轻炎症反应、改善肝功能作用，血脂和血清酶学检查结果与肝组织病理形态学检测结果并不完全一致，检测肝组织活检更有意义。虽然针刺治疗均有效，但选穴配伍至今尚缺乏系统而完整的标准，客观上多数处于自发状态，难以得到科学实验的证实，因此开展治疗高脂血症脂肪肝的腧穴配伍研究十分重要。

在本实验设计中，我们采用小周龄大鼠喂养高脂固体饲料方法进行造模，理由如下：①生长环境因素：有着明确的遗传背景优点的SD大鼠与人接近，从周龄小的开始喂养高脂饲料更容易改变机体内环境，诱发模型速度快；②体重、体长的变化：食用高脂饲料后，体重、体长呈上升趋势；③模型的可操作性：喂养固体饲料方便，较接近于人类饮食方式。

本实验在筛选文献的基础上，紧密结合临床实际，选定使用频次较高、理论记载完整的曲池、中脘、丰隆三穴，从一般情况、体重与对血液中各项指标含量的测定、肝脏病理学变化，便于了解高脂饲料对肝脏功能的影响。造模成功，针刺治疗4 w后，与模型组比较，针刺组TC、TG、LDL值均不同程度下降，HDL值升高，ALT、AST值下降。模型组肝脏有明显病理学损伤，表现为轻至中度脂肪肝。三穴组治疗效果较单穴、双穴组显著，肝小叶和肝窦结构清晰，细胞内脂滴数量减少，体积缩小。进一步验证三穴组具有良性调节血脂、肝功及改善肝细胞结构的优势。

通过实验证实，不同腧穴对高脂血症脂肪性肝病大鼠肝脏均有明显的保护作用，以“曲池”、“中脘”、“丰隆”三穴配伍疗效最优。筛选出针灸治疗高脂血症脂肪肝的最佳腧穴组方，为防治高脂血证脂肪肝提供客观可靠的实验依据。

［1］郭姣，朴胜华.从高脂血症发病低龄化趋势探讨其中医发病机制［J］.中医药信息，2008，25（6）：4-6.

［2］马奎军.中药配合针刺丰隆穴治疗高脂血症［J］.中国中医药现代远程教育，2008，6（5）：476.

［3］Yanaqisawa M，Kurihara H，Kimura S，et a1.A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells［J］.Nature，1988，322（6163）：411-415.

［4］Brown M S，Goldstin J L.A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis［J］.Science，1986，232（4746）：34.

［5］周利，万文俊，刘灵光，等.电针"丰隆"穴对高脂血症大鼠 NO、ET 及 CGRP 的影响［J］.中国针灸，2008，28（1）：57-60.

［6］谢凯，李海舟.强刺激针法对单纯性肥胖大鼠脂代谢的调节作用［J］.上海针灸杂志，2010，29（2）：122-124.

［7］夏棣其，刘淑娟，杨钦河.电针丰隆及足三里穴对非酒精性脂肪性肝炎大鼠的干预效应［J］.中国组织工程研究与临床康复，2007，47（11）：9483-9486.