玉米愈伤组织对除草剂的敏感性*

王红涛，徐 红，李艳臣

(通化师范学院 生命科学学院，吉林 通化 134002)

玉米是世界第三大粮食作物，其种植面积仅次于水稻和小麦，也是制药、淀粉、饮料、糖精和酒精工业的重要原料．玉米的品种改良现多集中于品质改良及各种抗性的研究，是进行生物技术研究和创新玉米品种资源的一个良好试验系统.本实验通过采用抗除草剂玉米自交系H99的胚性愈伤组织为材料，通过愈伤组织对Basta的敏感性实验，确定愈伤组织适宜的筛选浓度，并初步确定低浓度除草剂对愈伤组织增长有促进作用，高浓度具有抑制作用．通过本课题研究，可为玉米农作物的合理开发应用提供依据，另外为其新品种的研发提供理论基础．

1 实验材料

1.1 供试材料

H99玉米外植体

1.2 培养基

MS、N6、B5、MB、NB、NMB

1.3 实验试剂

除草剂、酒精、次氯酸钠、无菌水

1.4 实验仪器

超净工作台、冰箱、温度计、酸度计、分析天平、高压锅、酒精灯 试管、容量瓶、移液管等.

2 实验方法

2.1 培养基的选择

将授粉10～14d的H99玉米幼胚分别接种于Ms，N6，B5，MB，NB，NMB六种诱导培养基中，20d后观察愈伤组织诱导情况，此时多为I型愈伤组织，统计愈伤组织诱导率．计算公式为：愈伤组织诱导率=产生愈伤组织的量/接种总量．

2.2 玉米胚性愈伤组织的诱导

幼胚接种方法是取授粉后11～14d的H99外植体幼穗，将其拨去最外层数片苞叶，留3～5个苞叶，切去雌果穗头部无籽粒部分，幼胚长0.8～3.0mm在超净工作台上用75%酒精浸泡5～10min后移入5%次氯酸钠溶液浸泡15～20min，然后用无菌水冲洗3～4次，挑出幼胚长度在1.5mm左右的幼胚接到培养基上，在暗室中培养三周左右产生I型初始愈伤组织，温度26±1℃，观察愈伤组织诱导状况并统计愈伤组织诱导率，每隔20d继代1次，继代1～2次后即产生稳定的Ⅱ型愈伤组织，取继代2～3次的Ⅱ型愈伤组织作为农杆菌转化的受体材料．

2.3 除草剂的配制

除草剂Basta的原始浓度为13.5g·100mL-1取出2.22mL加47.7mL水稀释、抽滤灭菌得到6mg·L-1的除草剂母液浓度，在13个含有100mL培养基的锥形瓶中加入0、17、34、51、68、85、102、119、136、153、170、187、204μL的母液得到除草剂浓度分别为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12mg·L-1的筛选培养基．

2.4 愈伤组织的继代培养

在无菌工作台上将诱导出的生长旺盛、质地紧密、颜色鲜艳的玉米Ⅱ型愈伤组织用镊子分散为2～3mm左右的愈伤组织块，接种于培养皿中，并用电子天平称量所接愈伤组织的重量，培养两周后，称量愈伤组织的重量，计算愈伤组织的增殖指数．

3 结果与分析

3.1 不同培养基对H99玉米愈伤组织诱导的影响

在玉米胚性愈伤组织的获得中，培养基的选择尤为重要，只有使培养基适应胚性愈伤组织的要求，才能使好的愈伤组织在长期继代中保持良好的胚性状态，从而减少无性系变异并保持较好的胚性．本实验采用不同培养基对愈伤组织进行诱导，经计算得出结论：N6培养基的胚性愈伤组织诱导率最高．

3.2 玉米愈伤组织对Basta敏感性的测定

将H99的胚性愈伤组织转接于不同浓度的含Basta的筛选继代培养基上，26℃培养20d后观察愈伤组织褐变情况，各设置4次重复，统计结果见表1和图1．

表1 除草剂浓度对H99愈伤组织褐变率的影响

图1 愈伤组织筛选率曲线

3.3 除草剂浓度对H99玉米愈伤组织重量增长

将H99的胚性愈伤组织转接于不同浓度的含Basta的筛选继代培养基上，26℃培养20天后观察愈伤组织重量增重情况，各设置4次重复，统计结果见表2．

表1和表2未转化的试验结果表明8mg/L的除草剂为梯度筛选浓度．不同Basta浓度下玉米愈伤组织中的积累和组织的增重在加有除草剂的培养基上，随着除草剂的浓度增大，愈伤组织生长速率明显下降，愈伤组织褐变率也相应增高，增重指数呈下降趋势；当Basta浓度为8mg/L时，玉米愈伤组织的重量增长率随培养基中Basta浓度增加而降低，浓度高于8mg/L时对玉米愈伤组织的分化具有明显的抑制作用；当Basta浓度为10mg/L、11mg/L及12mg/L时，观察到大多数愈伤组织已经变褐死亡，重量不再增加．存活的愈伤组织生长较缓慢，部分丧失胚性．试验中还发现，不同生理状态下的组织对Basta除草剂的敏感性也不同，生长状态较好时，耐受性较强，反之较弱．

表2 除草剂浓度对H99玉米愈伤组织重量增长的影响

4 讨论

综上得出，N6培养基的愈伤诱导率和胚性愈伤诱导率最高，并且愈伤组织鲜黄色或浅黄色，愈伤组织表现良好的胚性;其次是NB， MB和Ms培养基，胚性愈伤诱导率也较高，愈伤组织诱导效果最差的是NMB培养基，不但愈伤组织诱导率较低，而且愈伤组织多为水渍状，并且多褐变．另外影响愈伤组织的诱导因素还有3点：①材料的遗传基础或称基因型的差异；②培养基培养条件、培养方式等外部条件；③外植体的生理条件状态和发育时期论．