高效液相色谱法测定血浆中瑞芬太尼含量

冯 锐，郑 颖，张俊贞，王明霞，刘 江，尉晓然(河北医科大学第四医院药学部，河北 石家庄 050011)

·论著·

高效液相色谱法测定血浆中瑞芬太尼含量

冯 锐，郑 颖，张俊贞，王明霞*，刘 江，尉晓然
(河北医科大学第四医院药学部，河北 石家庄 050011)

目的建立血浆中瑞芬太尼高效液相色谱测定方法，为临床合理用药提供依据。方法血浆样品用1-氯丁烷进行萃取，上清液提取至0.01mol/L盐酸溶液中。分析柱为spherisorb-CN，流动相为0.02mol/L的NaH2PO4水溶液-乙腈(70∶30)，内含三乙胺0.01%，流速1.5mL/min，柱温为室温，紫外检测波长为210nm，进样量为200μL。选择择期行胸科手术患者8例，靶控输注瑞芬太尼浓度(Cp)6μg/L复合异丙酚2.5mg/kg，分别在瑞芬太尼靶控输注前及靶控输注后5、10、20、30、60、90min时抽取桡动脉血，用高效液相色谱法测定瑞芬太尼血药浓度(Cm)。结果人血浆中瑞芬太尼检测浓度在2.5～300μg/L范围内线性关系良好(r=0.999 1)。日内日间精密度均在10%以内，提取回收率大于78.57%，方法回收率在96.03%～104.67%。在靶控输注5～20min时，瑞芬太尼测定浓度低于靶控输注浓度(P<0.05)，30～90min两者差异无统计学意义(P>0.05)。结论该方法操作简便，分离度好，其专属性、准确度、精密度、线性范围及稳定性均适合实际样品的检测。

瑞芬太尼；血浆；色变法，高压液相

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.09.016

瑞芬太尼(remifentanil)是一种新型的μ阿片受体激动剂，该药结构中含一个酯键，易被血液及其他组织中的非特异性酯酶快速降解，且有很强的脂溶性，广泛分布于组织中，具有起效迅速、镇痛效能强、作用持续时间短和可控性好等特点，是理想的静脉麻醉靶控输注药物[1]。有关瑞芬太尼血药浓度的测定方法,受灵敏度要求高的限制，目前报道多为液质联用[2]、气质联用[3]等，这些方法对检测仪器要求较高，成本较大，使其在临床上的应用受到限制。本试验建立高效液相色谱法测定瑞芬太尼血药浓度，旨在为临床合理用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器：高效液相色谱仪，包括515泵、2487紫外检测器(美国Waters公司)；800型离心机(上海手术器械厂)；XW80A旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)；梅特勒AE240电子分析天平(瑞士)。麻醉机Datex-OhmedaCapnomacUltimaTM芬兰；呼吸机Datex-Ohmeda7900SmartVent芬兰。

1.2 试药：盐酸瑞芬太尼对照品(中国药品生物制品检定所，批号171260-200601)；空白血浆(河北医科大学第四医院血液中心)；乙腈、甲醇为色谱纯；三乙胺、1-氯丁烷等其他试剂为分析纯；水为重蒸馏水。

1.3 标准溶液的配制：精密称取盐酸瑞芬太尼1mg，置于50mL量瓶中，用0.001mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，制成20mg/L的储备液，再依次稀释成1 000、100μg/L的标准溶液，分装后置-50℃冰箱保存。

1.4 缓冲溶液的配制：称取磷酸二氢钾2.72g放入烧杯中，加0.1mol/L氢氧化钠溶液158mL后加蒸馏水至200mL,调pH到7.4，配制成0.1mol/LKH2PO4缓冲溶液；称取磷酸二氢钠3.12g用1 000mL蒸馏水溶解，用1mol/L氢氧化钠溶液调至pH6.5，配制成0.02mol/LNaH2PO4缓冲溶液。

1.5 色谱条件：色谱柱Watersspherisorb-CN(250mm×4.6mm，5μm)；流动相，乙腈-0.02mol/LNaH2PO4缓冲液(pH6.5)(30∶70)，内含0.01%三乙胺,混匀后过滤超声备用；流速1.5mL/min；检测波长210nm；进样量200μL；室温下操作。

1.6 血浆样品处理：取含瑞芬太尼的血浆样品1.0mL置10mL具塞离心管中，迅速加入20μL10g/L枸橼酸和1mL0.1mol/LKH2PO4缓冲液(pH7.4)，混匀后精密加入5mL1-氯丁烷，上下振摇10次，涡旋5min，静置，离心(3 000r/min)10min。取上清液于含有0.01mol/L盐酸溶液300μL的离心管中，上下振摇10次，涡旋2min，离心(3 000r/min)3min，放入-50℃冰箱，待水相冰冻后，弃除有机相，取水相200μL进样于高效液相色谱法(highperformanceliquidchromarography，HPLC)分析。

1.7 研究对象：选择美国麻醉医师协会(ASA)评级为Ⅰ～Ⅱ级的胸外科全身麻醉手术患者8例，年龄40～60岁，体质量指数不超过30。排除有药物过敏史者，经身体检查心、肺、肝、肾功能不正常者，胆碱酯酶异常病史及家族史者，长期服用阿片类药物史者。剔除麻醉过程不平稳，有明显术中出血者。所有受试者试验前均签署患者知情同意书，试验方案经河北医科大学第四医院伦理委员会审查通过。

1.8 麻醉方法：所有患者均于麻醉前30min肌内注射咪达唑仑0.05mg/kg和阿托品0.5mg。患者入手术室后开放一侧上肢静脉通路，输注复方乳酸钠注射液8mL/kg，麻醉诱导用靶控输注瑞芬太尼6μg/L复合异丙酚2.5mg/kg，待患者意识消失后静脉注射罗库溴铵，行气管插管，插管成功后，连接Ohmeda7900型呼吸机行间歇正压通气，呼吸频率为14～16次/min，潮气量8～10mL/kg，呼吸比为1∶1.5，调节氧流量为1L/min，呼吸末二氧化碳分压控制在30～35mmHg。持续吸入七氟醚，间断注射维库溴铵维0.03mg/kg维持肌肉松弛。术毕给予新斯的明2mg和阿托品1mg拮抗残留肌肉松弛作用，患者自主呼吸完全恢复(呼吸频率>10次/min，PETCO2<50mmHg)，清醒后拔管。

1.9 取血方法：分别在麻醉前及瑞芬太尼靶控输注5、10、20、30、60、90min抽取桡动脉血3mL，置入肝素试管中，并迅速加入10g/L枸橼酸20μL，充分摇匀后离心取上清液，放入-50℃冰箱保存。

2 结 果

2.1 方法专属性考察：通过对瑞芬太尼对照品，空白血浆，含瑞芬太尼对照品血浆，患者用药后血样进行HPLC检测，结果表明，采用HPLC法测定人体血浆中瑞芬太尼的方法专属性良好。

2.2 标准曲线的绘制：取一定量瑞芬太尼标准溶液,用空白血浆依次稀释成2.5、5、10、25、50、100、200和300μg/L的血浆样品后，按“1.6”项下操作，制备工作曲线。以瑞芬太尼浓度为横坐标，瑞芬太尼峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为Y=503.14X-418.8，(r=0.999 1)。结果表明，血药浓度在2.5～300μg/L范围内有良好线性关系。最低定量限为2.5μg/L。

2.3 精密度试验：制备瑞芬太尼低、中、高浓度(分别为5、50、200μg/L)的血浆样品各6份，按“1.6”项下操作，连续测定3d，计算日内和日间精密度。高、中、低浓度的日间相对标准差(relativestandarddeviation,RSD)和日内RSD分别小于9.73%和8.01%。见表1。

Nominalconcentration(μg/L)Intra⁃dayMeasuredconcentration(μg/L)RSD(%)Inter⁃dayMeasuredconcentration(μg/L)RSD(%)54．87±0．398．014．83±0．479．735050．28±3．036．0348．25±2．755．70200212．82±7．913．72209．23±11．145．32

RSD：relative standard deviation

2.4 提取回收率试验：配制5、50、200μg/L的低、中、高浓度的瑞芬太尼血浆样品各5份，按“1.6”项下操作，记录瑞芬太尼峰面积，与相应浓度的瑞芬太尼工作液所测峰面积进行比较，比值即为提取回收率。见表2。

2.5 方法回收率试验：配制5、50、200μg/L的低、中、高浓度的瑞芬太尼血浆样品各5份，按“1.6”项下操作，将瑞芬太尼峰面积代入回归方程，求出瑞芬太尼浓度，按测定量除以加入量即为测定方法回收率。见表2。

Nominalconcentration(μg/L)ExtractionrecoveryRSD(%)MethodrecoveryRSD(%)578．57±3．764．7996．03±5．375．595083．72±2．312．7698．10±4．894．9820088．99±2．202．47104．67±4．584．38

RSD:relative standard deviation

2.6 稳定性试验：制备中等浓度瑞芬太尼(50μg/L)的血浆样品溶液，考察室温放置稳定性、冻存稳定性、冻融稳定性，RSD分别为5.52%、5.87%、6.58%。结果显示，分析过程中样品稳定。

2.7 患者血样测定：患者在靶控输注5～20min时,测定瑞芬太尼浓度(Cm)均低于靶控输注浓度(Cp)，差异有统计学意义(P<0.05),而TCI 30～90min时Cm与Cp差异无统计学意义(P>0.05)。靶控输液瑞芬太尼在5、10、20、30、90min的中位数浓度分别为4.0、4.5、4.7、5.1、5.3、5.3μg/L，瑞芬太尼总体血样Cm为5.1μg/L，低于Cp(P<0.05)。

3 讨 论

瑞芬太尼呈粉末状，易潮解,称量应迅速，其在酸性状态下稳定，因此用0.001mol/L盐酸溶解；温度是影响瑞芬太尼水解的主要因素[4]。本试验将血浆样品放在冰壶中，保证分析结果的准确性；枸橼酸的浓度需严格掌握，浓度较低(2～5g/L)不足以保证药物在血浆中的稳定性，浓度较高(20g/L)，影响1-氯丁烷的萃取率，本试验枸橼酸浓度为10g/L既可降低pH值抑制水解酶的活性，又不影响1-氯丁烷萃取率[5]；由于瑞芬太尼是碱性药物，加入KH2PO4缓冲液调pH值，可使样品成分子状态提高萃取效率。流动相中加入适量的三乙胺不仅有利于改善峰形，而且还可改变瑞芬太尼的保留时间，使其与干扰峰分开。本试验比较了不同流动相配比、磷酸盐缓冲液pH值(3.5和6.5)及三乙胺加入量(300μL/L和0.01%)，经研究本试验流动相具有峰形好、干扰小、准确定量的优点。

有文献[6]报道采用内标法测定瑞芬太尼浓度，主要内标物有GI97559(瑞芬太尼乙基类似物)、芬太尼、氯雷他定[7]、卡马西平[8]等。内标GI97559在国内较难找到；试验研究用氯雷他定为内标，采用氮气吹干法，发现样品易分解且杂质峰较多。本试验利用现有条件，对测定方法进行综合比较并改进，建立无内标的高效液相色谱法。

有文献[9]报道提取溶剂可选1-氯丁烷、二氯甲烷、甲基叔丁醚等。二氯甲烷比重较大，萃取时有机相取出较难，且杂质较多；虽然甲基叔丁醚毒性较小，但本试验经比较使用1-氯丁烷提取效率较高，满足试验要求。萃取时间短，萃取率低,不利于检测；如果延长萃取时间和增加萃取次数,则处理总时间太长，影响瑞芬太尼稳定性。经过比较,采用5mL 1-氯丁烷漩涡5min,单次萃取即可取得满意的结果。萃取时不能过度振摇，否则易发生乳化现象。1-氯丁烷萃取时，溶剂可能使具塞离心管的胶塞变形，造成液体溢出，影响测定结果的准确性。本试验在具塞离心管胶塞盖上添加双层铝箔，既不产生干扰，又保证液体不会溢出，在国内文献中尚未提及。

赵高峰等[5]处理血样时，先加甲醇沉淀蛋白防止萃取涡旋时标本的乳化，降低瑞芬太尼的酯酶水解。本试验对加入甲醇前后进行比较，发现对结果影响不大，可简化此步骤，减少药物测定的干扰。

由于靶控输注系统采用的群体药代动力学参数与个体之间存在一定的差异，因此靶控输注系统并不能准确地预测个体的实际血药浓度水平。本试验结果表明随着输注时间的延长，实际测定浓度与靶控输注浓度逐渐接近，提示临床麻醉医师应根据实际情况调整麻醉剂量，保证患者麻醉期间的稳定性。

本试验建立以高效液相色谱法测定瑞芬太尼的含量，方法简单、快速、有效，为临床上对瑞芬太尼血药浓度的监测提供了较好的分析方法。

[1] 高秀江，毛瑞芬，宋铁鹰，等.靶控输注瑞芬太尼不同时点血药浓度及对心率和血压的影响[J].河北医科大学学报，2007,28(2):139-141.

[2] KABBAJ M,VARIN F.Simultaneous solid-phase extraction combined with liquid chromatography with ultraviolet absorbance detection for the determination of remifentanil and its metabolite in dog plasma [J].J Chromatogr B,2003,783(1):103-111.

[3] 张永红，曹伟，刘进.气相色谱-质谱联用法测定人血浆中瑞芬太尼浓度[J].中国医院药学杂志，2009,29(3):197-200.

[4] 邢玉英，张加强，赵国利，等.高效液相色谱紫外检测法测定人血瑞芬太尼血药浓度[J].河北医药，2005,27(12): 947-948.

[5] 赵高峰，张兴安，吴群林，等.HPLC-UV测定人血浆瑞芬太尼浓度 [J].中国药学杂志，2005，40(10): 783-785.

[6] HAIDAR SH，LIANG Z,SELINGER K,et al.Determination of remifentanil,an ultra-short-acting opioid anesthetic,in rat blood by high performance liquid chromatography with ultraviolet detection[J].J Pharm Biomed Anal,1996,14(12):1727-1732.

[7] 张弨，张利萍，张现化，等.液-质联用法测定瑞芬太尼在手术患者的全血浓度及其药代动力学 [J].中国临床药理学杂志，2006，22(5): 361-364.

[8] 郑海珍，郑海燕，肖忠祥，等.液相色谱-串联质谱法测定人血浆中瑞芬太尼的浓度及药动学[J].中国新药与临床杂志，2011,30(3):211-215.

[9] 唐丽琴，张善堂，胡利国，等.HPLC法测定围手术期患儿血浆中瑞芬太尼浓度[J].中国药师杂志，2012,15(7):990-992.

(本文编辑：赵丽洁)

DETERMINATIONOFREMIFENTANILCONCENTRATIONINPLASMABYHIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMAROGRAPHY

FENGRui,ZHENGYing,ZHANGJunzhen,WANGMingxia*，LIUJiang，YUXiaoran
(DepartmentofPharmacy,theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China)

ObjectiveHighperformanceliquidchromarography(HPLC)methodwasestablishedfordeterminationofremifentanilinplasma.Thestudywillprovideacademicfoundationforthedevelopmentandclinicaluseofremifentanil.MethodsThesamplesextractedwith1-chlorobutaneandsupernatantwasbackextractedinto0.01mol/LHClagain.Theseparationwasperformedonaspherisorb-CNcolumnwithamobilephaseof0.02mol/L-1NaH2PO4-acetonitrile(70∶30)including0.01%triethylamineataflowrateof1.5mL/min.Thecolumntemperaturewasroomtemperature,thedetection-wavelengthwas210nmand200μLofsolutionwasinjectedintoHPLC.Eightpatientsundergoingthoracicsurgerywereassignedtoreceiveremifentaniltargetcontrolledinfusion(TCI) (6μg/L)andpropofolintravenousinjection(2.5mg/kg).ArterialbloodsamplesweretakenbeforeandafterTCIremifentanil5,10,20,30,60,90minformeasuringofbloodconcentrationofremifentanilbyHPLC.ResultsAlinearitywasobtainedfrom2.5μg/Lto300μg/Lofremifentanilinplasmawithagoodcorrelation(r=0.999 1).Thebetween-dayandwithin-dayRSD%werelessthan10%.Theextractionrecoveriesweremorethan78.57%,andthemethodrecoverieswerebetween96.03%and104.67%.ThedeterminationoftheconcentrationwaslowerthantargetplasmaconcentrationatTCI5minto20min(P<0.05)andtherewasnosignificantdifferencefrom30minto90min(P>0.05).ConclusionThisHPLCmethodissimple,sensitiveandaccurate,anditissuitableforroutinedeterminationofremifentanillevelsinhumanplasma.

remifentanil;plasma；chromatography,highpressureliquid

2013-09-24；

2013-11-05

河北省医学科学研究重点课题计划(ZL20140342)

冯锐(1981-)，男，河北石家庄人，河北医科大学第四医院主管药师，理学硕士，从事药动学和药物相互作用研究。

*通讯作者

R927.2

A

1007-3205(2014)09-1040-04