丁苯酞对局灶性脑梗死大鼠皮层Rho相关激酶Ⅱ蛋白表达的影响

张春梅，王丽娜，刘永亮(河北省唐山市人民医院神经外科，河北 唐山 063000)

·论著·

丁苯酞对局灶性脑梗死大鼠皮层Rho相关激酶Ⅱ蛋白表达的影响

张春梅，王丽娜，刘永亮*
(河北省唐山市人民医院神经外科，河北 唐山 063000)

目的探索丁苯酞对局灶性脑梗死大鼠模型皮层Rho相关激酶Ⅱ(Rho-associated kinase Ⅱ,ROCKⅡ)表达的影响。方法成年Sprague-Dawley 雄性大鼠45只，随机分为假手术组15只，对照组15只，丁苯酞组15只。应用光化学法建立局灶性脑梗死大鼠模型。术后24h行干湿质量法检测各组大鼠脑组织含水量变化，行免疫组织化学和Western Blot检测各组大鼠梗死区周围皮层ROCKⅡ蛋白表达水平。结果与假手术组比较，对照组和丁苯酞组脑组织含水量明显增加，梗死区周围皮层ROCKⅡ蛋白表达明显增加。丁苯酞组脑组织含水量较对照组降低，梗死区周围皮层ROCKⅡ蛋白表达减少。结论丁苯酞可降低局灶性脑梗死大鼠皮层ROCKⅡ蛋白的表达，减轻脑水肿的形成。

脑梗死；丁苯酞；模型，动物

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.09.004

脑水肿是脑梗死后的主要继发性病理过程，可加重脑组织缺血缺氧，是导致患者病死率和残疾率增高的主要原因之一[1]。Rho相关激酶(Rho-associatedkinase,ROCK)Ⅱ是Rho信号通路的重要底物之一，ROCKⅡ的激活可进而激活肌球蛋白轻链磷酸酶，导致肌球蛋白轻链磷酸化，血脑屏障通透性增高，脑水肿加重[2]。丁苯酞是治疗急性缺血性脑血管病的一种新药。本研究采用光化学法制造局灶性脑梗死大鼠模型，观察丁苯酞对局灶性脑梗死大鼠脑水肿和ROCKⅡ蛋白表达水平的影响，旨在为丁苯酞的临床应用探索新的证据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组：清洁级健康成年Sprague-Dawley雄性大鼠45只，体质量280～320g，3个月龄，购自北京维通利华公司，合格证为SCXL(京)2002-003。饲养于河北联合大学动物饲养中心，自然光照，环境安静，维持室温在20～25℃，自由进食饮水。所有动物按随机数字表法分为假手术组15只，对照组15只，丁苯酞组15只。丁苯酞组大鼠给予丁苯酞软胶囊(石药集团恩必普药业有限公司，应用植物油配制成100mg/mL)0.4mL/kg灌胃(1次/d)，假手术组和对照组给予0.4mL/kg植物油灌胃。所有实验过程遵循国际生命指导中心“关心和使用动物实验原则”。

1.2 模型制作：对照组和丁苯酞组大鼠采用10%水合氯醛3～5mL/kg腹腔麻醉，经尾静脉注入光敏剂红四氮唑(即玫瑰红B)150mg/kg，SR-5立体定位仪(日本Narishige公司)固定大鼠头部，常规消毒，沿正中线切开头皮，暴露右侧颅骨，于前囟右3mm后2mm处，磨钻磨除直径约6mm外层颅骨，LG-150绿色冷光源[徐州恒发有限公司，波长(560±30)nm，光照强度5.6×105，照射中心最高温度为27℃]照射30min，缝合皮肤。假手术组仅尾静脉注射生理盐水，只暴露颅骨，磨除外板，照射时间同上。在实验动物麻醉清醒后，应用Longa标准[3]进行大鼠行为学评分。0分，无缺陷；1分，不能伸展对侧前肢；2分，对侧前肢屈曲；3分，轻度向对侧转圈；4分，严重向对侧转圈；5分，向对侧跌倒。评分1～3分者纳入实验，不符合标准者随机补充。

1.3 脑组织含水量测定：随机选取各组大鼠各5只，于术后24h采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，断头处死，开颅取脑，从梗死周围区取200mg左右的脑组织，应用MA110电子分析天平(上海第二天平仪器厂)称湿质量并记录，然后置于105℃恒质量干燥箱内干燥48h至恒质量，称干质量后按Elliot公式计算脑含水量。脑含水量计算公式=(湿质量-干质量)/湿质量×100%。

1.4 免疫组织化学染色法检测梗死周围皮质ROCKⅡ蛋白阳性细胞数量：随机选取各组大鼠各5只，于术后24h采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛经左心室穿刺至主动脉进行灌注，断头取脑，置于4%多聚甲醛中4℃冰箱过夜，自红色梗死灶前边界向后冠状切取2mm厚包含梗死区及左右半球的组织块，自来水冲洗48h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片机连续切片，片厚5μm。取各大鼠同部位切片3张，经二甲苯二级脱蜡各5min，梯度乙醇脱水，3%过氧化氢室温浸泡10min以消除内源性过氧化物酶，高压热修复，滴加1∶100比例稀释的ROCKⅡ一抗(武汉博士德生物工程有限公司)4℃过夜，次晨取出置常温，磷酸盐缓冲液冲洗，滴加二抗，37℃孵育1h，二氨基联苯胺显色，水冲洗后苏木精复染，脱水，透明，中性树胶封片。光镜下观察细胞核呈蓝色，阳性细胞肿胀，胞质黄染。在400倍显微镜下在梗死灶周围随机选取5个视野，应用ImagePro-Plus图像分析系统5.0(美国MediaCybernetics公司)照相后计算每个视野中的阳性细胞数量。

1.5 蛋白质印迹法检测梗死周围皮质ROCKⅡ蛋白表达：应用细胞裂解液提取各组大鼠术后24h梗死周围脑组织总蛋白(每组各5只)运用考马斯亮蓝比色法测定各个样本蛋白含量，上样量为100μg蛋白。15%SDSPAGE凝胶电泳，硝酸纤维素膜转膜，5%脱脂奶粉封闭；加入山羊抗ROCKⅡ(rI′11r18/serl9)多克隆一抗(1∶500)(武汉博士德生物工程有限公司)、山羊抗β-肌动蛋白多克隆一抗(1∶1 000)(武汉博士德生物工程有限公司)，4℃过夜，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1∶1 000)(武汉博士德生物工程有限公司)。增强化学发光溶液(美国pierce公司)3min，曝光、显影、定影。采用数码成像分析系统软件分析平均灰度值，取目标平均灰度值与内参平均灰度值的比值。

2 结 果

与假手术组相比，对照组和丁苯酞组大鼠梗死24h后脑组织含水量均显著增高(P<0.05)；丁苯酞组大鼠梗死24h后脑组织含水量较对照组显著降低(P<0.05)。在免疫组织化学试验中，假手术组可见少量被染成棕黄色的阳性细胞；与假手术组相比，对照组和丁苯酞组梗死24h后梗死周围阳性细胞数量均显著增多(P<0.05)；丁苯酞组梗死24h后梗死周围阳性细胞数量较对照组显著减少(P<0.05)。在免疫印记试验中，与假手术组比较，对照组和丁苯酞组梗死24h后梗死周围脑组织ROCKⅡ含量均显著增高(P<0.05)；丁苯酞组梗死24h后梗死周围皮质ROCKⅡ含量较对照组显著降低(P<0.05)。见表1。

GroupsBrainwatercontentROCKⅡ(Immunohistochemistry)ROCKⅡ(WesternBlot)Sham71．78±0．7238．20±10．4760．80±9．68Control79．33±0．49∗195．60±15．31∗121．00±12．79∗Butylphthalide77．49±0．34∗#124．20±16．33∗#86．40±9．56∗# F273．122152．56939．266 P0．0000．0000．000

*P<0.05vssham group #P<0.05vscontrol group byqtest
ROCKⅡRho-associated kinase Ⅱ

3 讨 论

脑梗死是一种临床常见的缺血性脑血管病，严重危害着人类的生命和健康。急性缺血性脑血管病可引起局部脑组织微循环障碍，缺血缺氧，甚至引起炎症反应、自由基损伤、血脑屏障通透性增高等病理过程，导致脑水肿形成[4]。脑水肿形成后可进一步加重脑组织缺血缺氧，并且可引起颅内压增高，甚至形成脑疝，明显加重患者的症状，影响患者的预后[5]。因此，对脑水肿的形成机制及治疗方法进行进一步的探讨，对缺血性脑血管病的治疗具有重要的指导意义。

Rho蛋白家族是Ras超家族小相对分子质量单体结合蛋白。Rho蛋白的主要功能是调节肌动蛋白细胞骨架的重建[6]。Rho蛋白通过Rho信号通路参与包括炎症反应在内的多种生物学过程。ROCK是Rho的重要效应底物之一，是一种丝氨酸/苏氨酸激酶。本研究结果表明，ROCKⅡ参与了脑梗死的病理过程。当ROCK接受了Rho传递的活化信号，可发生多个氨基酸位点的磷酸化，包括肌球蛋白磷酸酶的磷酸化[7]。肌球蛋白磷酸酶磷酸化后活性消失，肌球蛋白轻链脱磷酸化受阻，使得胞浆内肌球蛋白轻链磷酸化水平增高，肌动蛋白微丝骨架聚合，血管内皮骨架发生变化，血管内皮收缩，内皮通透性增高[8]。我们推测，ROCKⅡ通过此途径参与了脑梗死后脑水肿的发生。

丁苯酞是从芹菜籽中提取的一种有效成分，动物实验提示，丁苯酞可以增加缺血区的脑组织的血流量，重建缺血区微循环；保护线粒体功能，改善脑组织能量代谢[9]。本研究结果显示丁苯酞可通过调控ROCKⅡ的表达减轻脑梗死后脑水肿的形成。有研究[10]表明丁苯酞还能够减少梗死区中性粒细胞数量以及白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎性细胞因子的表达。细胞外血管紧张素Ⅱ和IL-1β可上调RhoA表达并增强其活性[11]。TNF-α可通过其受体激活RhoA，进而激活Rho三磷酸鸟苷酶，促进肌球蛋白轻链磷酸化，导致平滑肌对Ca2+的敏感性增高，肌动球蛋白收缩力增大，血管平滑肌收缩，从而加重细胞毒性脑水肿[12]。由此可见，脑缺血后的应激反应和炎症反应与Rho信号通路密切相关。此外，丁苯酞还具有抑制脑缺血患者血清C反应蛋白表达的作用[13]，而唐淑俊等[14]的研究表明，炎性细胞因子和C反应蛋白与脑梗死后脑水肿的关系密切。我们推测，脑梗死引起的炎症反应会激活RhoA，进而激活ROCK，导致肌球蛋白轻链磷酸化，血脑屏障通透性增高，脑水肿加重。而丁苯酞可通过抑制IL-1β和TNF-α的表达，抑制ROCK的激活，从而减轻脑梗死后脑水肿的形成。

[1] 陈通,孙善全.创伤性脑水肿发生机制的研究[J].四川解剖学杂志,2005,13(2):15-19.

[2] 唐华,赵合庆.Rho/ROCK与神经系统疾病[J].国际脑血管病杂志,2008,16(3),233-236.

[3] 屈秋民，曹振玲，杨剑波.线栓法大鼠大脑中动脉闭塞局灶性脑缺血模型longa法和小泉法的比较[J].中华神经外科杂志,2000,22(5):289-291.

[4] 丁洁,程焱.Rho/Rho激酶信号通路与缺血性脑血管病[J].国际脑血管病杂志,2007,15(9):707-710.

[5] 高艳,谢敏.Rho/Rho激酶信号通路与低氧所致肺纤维化[J].国际呼吸杂志,2009,29(18):1120-1126.

[6] 赵世义.Rho蛋白及其抑制剂[J].国际肿瘤学杂志,2008,35(2):110-112.

[7] 李琴,李晓宇,刘皋林.Rho激酶的生理及病理生理研究进展[J].中国药学杂志,2011,46(24):1860-1864.

[8] 刘薇薇,崔桂云,沈霞.Rho激酶与缺血性脑血管病[J].国际脑血管病杂志,2009,17(8):626-635.

[9] 刘永亮,王丽娜,李建民，等.丁苯酞对局灶性脑梗死大鼠脑水肿及咬合蛋白表达的影响[J].临床神经外科杂志,2013,10(3):156-158.

[10] XU HL,FENG YP.Inhibitory effects of chiral 3-n-butylphthalide on inflammation following focal ischemic brain injury in rats[J].Acta Pharmacol Sin,2000,21(5): 433-438.

[11] HIROKI J,SHIMOKAWA H,HIGASHI M,et al.Inflammatory stimuli upregulate Rho-kinase in human coronary vascular smooth muscle cells[J].J Mol Cell Cardiol,2004,37(2): 537-546.

[12] DOE C,BENTLEY R,BEHM DJ,et al.Novel Rho kinase inhibitors with anti-inflammatory and vasodilatory activities[J].J Pharmacol Exp Ther,2007,320(1): 89-98.

[13] 朱海生.丁苯酞对慢性脑供血不足患者血清高敏C反应蛋白的影响[J].中华实用诊断与治疗杂志,2012,26(1):73-74.

[14] 唐淑俊,梅凤君.炎性细胞因子和C-反应蛋白在急性脑梗死中的变化及相关性研究[J].河北医科大学学报,2010,31,(11):1347-1350.

(本文编辑：许卓文)

BUTYLPHTHALIDEONCORTEXEXPRESSIONOFRHO-ASSOCIATEDKINASEⅡINRATSAFTERFOCALCEREBRALINFARCTION

ZHANGChunmei,WANGLina,LIUYongliang*
(DepartmentofNeurosurgery,TangshanPeople′sHospitalofHebeiProvince,Tangshan063000,China)

ObjectiveToexploretheeffectofbutylphthalideonthecortexexpressionofRho-associatedkinaseⅡ(ROCKⅡ)inratsafterfocalcerebralinfarction.MethodsForty-fiveSprague-Dawleymaleratsweredividedintoshamgroup,controlgroupandbutylphthalidegroup.Themodelwasmadebyphotochemicalmethod.Afterinjury24h,brainwatercontentwasmeasuredtoobservethechangesofthebrainedema,theimmunohistochemistryandWesternBlotweredonetoexaminethecortexexpressionofROCKⅡaroundtheinfarctionarea.ResultsComparedwiththeshamgroup,thebrainwatercontentofthecontrolgroupwasmoreenhanced,thecontentofROCKⅡaroundtheinfarctionareawasincreased.Comparedwiththecontrolgroup,thebrainwatercontentofthebutylphthalidegroupwasless,thecontentofROCKⅡaroundtheinfarctionareaofbutylphthalidegroupwasdecreased.ConclusionButylphthalidecouldreducethecortexexpressionofROCKⅡinratsafterfocalcerebralinfarction,andthusalleviatethebrainedema.

braininfaction;butylphthalide;modes，animal

2014-02-22；

2014-04-30

张春梅(1973-)，女，河北唐山人，河北省唐山市人民医院主管护师，医学学士，从事重症护理研究。

*通讯作者

R743.33

A

1007-3205(2014)09-1003-03