基质金属蛋白酶3基因多态性与汉族人结肠癌的相关性

任志国(山东医学高等专科学校附属医院普通外科,山东 临沂 276004)

·论著·

基质金属蛋白酶3基因多态性与汉族人结肠癌的相关性

任志国
(山东医学高等专科学校附属医院普通外科,山东 临沂 276004)

目的探讨汉族人基质金属蛋白酶3(matrix metalloproteinase-3，MMP-3)基因启动子区多态性与结肠癌的关系。方法应用限制性片段长度多态性方法检测116例结肠癌患者和130例正常对照者的MMP-3基因启动区-1171 5A/6A 多态性，分析其基因型与结肠癌发病风险及临床分期的相关性。结果结肠癌患者5A/5A+5A/6A基因型频率显著高于对照组(OR=2.104，95%CI=1.247～3.549)，推断携带5A/5A基因型的个体发生结肠癌的风险明显增加。而且在结肠癌中，MMP-3-1171 5A/6A 多态性与肿瘤的侵袭转移密切相关，差异有统计学意义(P<0.05)。结论MMP-3基因启动区-1171 5A/6A 多态性可能与汉族人群结肠癌的遗传易感性及肿瘤的侵袭转移相关。

结肠肿瘤；基质金属蛋白酶3；多态现象,遗传

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.09.005

结肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈上升趋势，积极预防及早期发现，并积极采取有效的治疗措施，成为广大医务工作者的共同任务和目标。结肠癌的病因尚未完全阐明，目前认为可能与环境因素及基因变异有关。有研究[1-2]证实，基质金属蛋白酶3(matrixmetalloproteinase-3，MMP-3)基因多态性与肺癌、食管癌、乳腺癌等肿瘤发生发展相关，但与结肠癌的关系，目前国内外相关文献报道较少。MMP-3基因启动子区存在5A/6A多态性，影响到基因的转录水平，导致基因功能改变。本研究采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(polymerasechainreactionrestrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR-RFLP)方法初步探讨MMP-3基因启动区-1171(5A/6A)的单核苷酸多态性与我国汉族人结肠癌发病的关系，旨在为其早期发现及预后提供依据。报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选择2011年1月—2013年9月在山东医学高等专科学校附属医院经病理诊断确诊的结肠癌患者116例，男性69例，女性47例，年龄30～76岁，平均(47.90±11.15)岁。其中包括TNM国际分期Ⅰ期23例，Ⅱ期43例，Ⅲ期32例，Ⅳ期18例。另选择同期健康体检者130例作为正常对照，男性74例，女性50例，年龄29～73岁，平均(45.48±8.25)岁，既往无肿瘤病史，无肿瘤家族史和其他遗传病史。所有研究对象均为汉族，无血缘关系，且均排除其他呼吸系统疾病、肾炎、风湿性疾病及纤维化病变等影响基质金属蛋白酶表达的相关疾病。2组性别、年龄比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 仪器及试剂：Taq酶(上海复华生物技术有限公司提供)；PCR扩增仪(美国PEC公司生产)。使用Primerpremier5.0软件设计PCR引物和测序引物；引物合成及测序由北京六合华大生物科技发展有限公司完成。

1.3 人血DNA提取：所有对象抽取清晨空腹静脉血4mL，经枸橼酸钠抗凝，于-20℃冰箱保存，常规酚-氯仿抽提法获得外周血白细胞DNA。

1.4MMP-3基因启动区-1171(5A/6A)的单核苷酸多态性测定：MMP-3基因型检测采用PCR-RFLP方法进行。

MMP-3基因启动区-1171 5A/6A上下游扩增引物分别为5′-GGTTCTCCATTCATGGGGGGAAAG-A-3′和5′-CTTCCTGGAATTCACATCACTGCCACCA-CT-3′，上游引物靠近3′末端的第二个核苷酸发生A→G替代，从而产生一个TthlllⅠ限制性酶切位点，5A等位基因存在该识别位点。

PCR反应组分为模板DNA100ng，10×PCR缓冲液2.5μL，Taq-DNA聚合酶2.5U,MgCl22.0mmol/L，4种dNTP的终浓度各为200μmol/L，上下游引物各200μmol/L，Taq酶1U，总反应体积为25μL。PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃ 30s，72℃ 60s，35个循环后，72℃延伸5min。

PCR产物进行限制性内切酶消化，经3%琼脂糖凝胶电泳分析基因型。MMP-3基因的PCR产物为129bp，经TthlllⅠ65℃消化4h后,5A等位基因的产物为97bp和32bp，而6A等位基因为129bp。

1.5 统计学方法：应用SPSS13.0软件包处理数据。采用基因计数法计算各组的基因型频率和等位基因频率(检验是否符合Hardy-Weinberg平衡)，2组基因型频率的分布采用χ2检验，并分析各基因型和临床分期的关系，估计研究因素对结肠癌危险度采用比值比(oddsratio，OR)和95%可信区间(confidenceinterval，CI)。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 2组MMP-3基因启动区-1171 5A/6A多态位点的基因型分布：2组MMP-3基因启动区-1171 5A/6A单核苷酸多态的基因型分布差异有统计学意义(P=0.019)。结肠癌组5A等位基因频率高于对照组(P=0.009)。见表1。

对正常对照人群进行遗传平衡检验，发现MMP-3 基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，说明该人群具有群体代表性。

表1 2组MMP-3基因型和等位基因频率分布比较Table 1 Distribution of the genotypes and allele frequences of MMP-3 in two groups (n，%)

2.2 MMP-3基因启动区-1171 5A/6A多态性对结肠癌发病危险度的影响：由于5A/5A基因型频率在结肠癌组和对照组中均很低，因此将5A/5A基因型和5A/6A基因合并后进行分析。经χ2检验，结肠癌组5A/5A+5A/6A基因型频率显著高于对照组(P=0.005，OR=2.104，95%CI=1.247～3.549)，推断携带5A/5A基因型的个体发生结肠癌的风险明显增加。见表2。

表2 MMP-3基因多态性对结肠癌发病危险度的影响Table 2 Association of MMP-3 polymorphism with the risk of developing colon cancer (n，%)

OR：odds ratio；CI：confidence interval

2.3 MMP-3基因型与结肠癌临床分期之间的关系：在结肠癌患者中，TNM国际分期Ⅰ期和Ⅱ期无淋巴或远处转移，Ⅲ期和Ⅳ期有淋巴或远处转移，故将Ⅰ、Ⅱ期及Ⅲ、Ⅳ期分别一起讨论，分析结肠癌侵袭转移与MMP-3基因型的关系。对照组与Ⅰ、Ⅱ期患者比较，基因型分布差异无统计学意义(P=0.490)。Ⅲ、Ⅳ期患者5A/5A+5A/6A基因型频率显著高于Ⅰ、Ⅱ期患者，差异有统计学意义(P=0.002，OR=3.324，95%CI=1.542～7.164)，提示携带5A等位基因与结肠癌的侵袭转移关系密切。见表3。

表3 MMP-3基因型与结肠癌临床分期之间的相关性Table 3 Association of MMP-3 polymorphism with colon cancer clinical stage (n，%)

*P<0.05vscontrols #P<0.05vsStageⅠand Ⅱ by χ2test

3 讨 论

基质金属蛋白酶是一个大家族，由结缔组织分泌，因其需要Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅助因子而得名，其家族成员具有相似的结构，一般由信号肽区、前肽区、催化区、铰链区及血红素结合蛋白样区5个功能不同的结构域组成，各种基质金属蛋白酶间具有一定的底物特异性，但不是绝对的，同一种基质金属蛋白酶可降解多种细胞外基质成分，而某一种细胞外基质成分又可被多种基质金属蛋白酶降解，但不同酶的降解效率不同[3-4]。基质金属蛋白酶几乎能降解细胞外基质中的各种蛋白成分,破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿瘤侵袭转移中起关键性作用，从而在肿瘤浸润转移中的作用日益受到重视[5]，被认为是该过程中主要的蛋白水解酶，目前基质金属蛋白酶家族已分离鉴别出26个成员，MMP-3又称为基质分解素1，为基质金属蛋白酶中最重要的一种，MMP-3不仅与肿瘤的生长有关，而且可以破坏基底膜，促使肿瘤的侵袭转移和血管生成[6]。MMP-3基因位于11号染色体长臂，其启动子区的-1171位点因存在5个腺苷或6个腺苷不同而存在5A/6A多态性[7]。研究发现MMP-3基因启动子区多态性可能以等位基因特异方式调节MMP-3基因的转录[8]。

目前MMP-3与肿瘤的研究较多，贺军等[9]发现，MMP-3在肝内胆管结石患者中呈阴性表达，在肝细胞癌组织中呈阳性表达，主要分布在癌细胞的细胞质和细胞膜中及血管内皮细胞中，提示MMP-3可能与肝细胞癌的发生及血管生成密切相关。朱之坤等[10]认为MMP-3在人乳腺癌发展过程中发挥重要作用。

本研究结果发现，我国汉族人MMP-3基因启动区-1171 5A/6A多态性与结肠癌发病关系密切。结肠癌组5A/5A+5A/6A基因型频率显著高于对照组，提示携带5A等位基因的个体发生结肠癌的风险明显增加。而且TNM Ⅲ、Ⅳ期患者5A/5A+5A/6A基因型频率显著高于Ⅰ、Ⅱ期患者，提示携带5A等位基因的结肠癌患者，肿瘤更易发生侵袭转移。另外，对照组与Ⅰ、Ⅱ期患者比较，基因型分布差异无统计学意义，并不意味结肠癌患者发病与MMP-3基因单核苷酸多态性无相关性，可能与所选病例数尚少等有关，有待进一步研究。

结肠癌是一种生长较慢的恶性肿瘤，原发癌肿的倍增时间平均为620d。早期可无症状或因其早期症状缺乏特异性而不引起患者和医师的注意，发现时常为中晚期。总之，我国汉族人群MMP-3基因启动区-1171 5A/6A多态性与结肠癌易感性关系密切，而且与肿瘤的侵袭转移相关，为结肠癌的早期发现、判断预后等提供了依据。

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[9] 贺军,丁成明,贺更生,等.ESM-1和MMP-3表达与肝癌侵袭转移的关系[J].中南医学科学杂志,2012,40(4):368-372.

[10] 朱之坤,刘志容,吴诚义.MMP-3与乳腺癌上皮间质转化的关系及其意义[J].生命科学研究,2012,16(1):63-67.

(本文编辑：赵丽洁)

CORRELATIONBETWEENPOLYMORPHISMOFMATRIXMETALLOPROTEINASE-3GENEANDCOLONCANCEROFHANNATIONALITYPATIENTS

RENZhiguo
(DepartmentofGeneralSurgery，theAffiliatedHospitalofShandongMedicalCollege,ShangdongProvince，Linyi276004,China)

ObjectiveToinvestigatewhetherthepolymorphismofmatrixmetalloproteinase-3(MMP-3)promotercontributestothedevelopmentandprogressionofcoloncancerinHannationalitypopulation.MethodsPCR-restrictionfragmentlengthpolymorphismwasappliedtoanalyzetheMMP-3 -1171 5A/6Apolymorphismsincoloncancergroup(116cases)andnormalgroup(130cases).Genotypefrequencieswerecomparedbetweenpatientsandmatchedcontrols,andtheassociationofgenotypeswithclinicalstageswerestudiedincoloncancerpatients.TherelativitybetweenthetumorinvasionandMMP-3-1171 5A/6Apolymorphismincoloncancerpatientswasanalysed.ResultsThefrequencyofthe5A/5A+5A/6AgenotypesintheMMP-3genepolymorphismwassignificantlyhigherincoloncancerpatientsthanthatofcontrols(OR=2.104，95%CI=1.247-3.549),andindividualswith5A/5Agenotypehadanincreaseriskofdevelopingcoloncancercomparedtothosewith6A/6Agenotype.TheMMP-3-1171 5A/6Apolymorphismwaspositivelycorrelatedwiththetumorinvasionincoloncancerpatients(P<0.05).ConclusionMMP-3-1171 5A/6ApolymorphismmaybeassociatedwithgeneticsusceptibilitytocoloncancerandtheinvasivecapabilityofcoloncancerinHannationalitypatients.

colonicneoplasms；matrixmetalloproteinase3；polymorphism,genetic

2014-07-22；

2014-08-27

任志国(1962-)，男，山东海阳人，山东医学高等专科学校附属医院副主任医师，从事消化系统肿瘤诊治研究。

R735.35

A

1007-3205(2014)09-1006-04