染色体畸变分析实验条件探讨

陈洋

染色体畸变分析实验条件探讨

陈洋

目的 探讨如何确立外周血淋巴细胞培养染色体畸变分析实验条件, 以获得良好的制片效果。方法 在已消毒好备用的超净台内, 用碘伏消毒采血管的头部, 轻轻混匀后接种, 加入秋水仙素工作液, 经混匀、培养、收集细胞并离心后, 弃上清液, 加入低渗液混匀, 给予预固定；重复固定后依细胞数量加入适量固定液, 制片、染色、气干。于低倍镜下细致观察, 计数200个分裂相。结果 细胞生长良好, 分裂指数高, 能够满足分析要求, 染色体分散均匀, 着色良好, 长短适中, 两条姐妹染色体大致平行分离, 着丝粒清晰。结论 寻找适合自己实验室的实验条件能提高染色体畸变的检出率和阅片速度, 及时准确地反映辐射损伤情况, 对放射工作人员健康进行监护, 为意外放射性损伤事故进行生物剂量估算, 为放射患者诊断与治疗提供依据。

染色体畸变；实验条件

人体受到一定剂量的电离辐射后, 即可见到染色体的变化, 称为染色体畸变。染色体畸变分析是放射工作人员健康监护和慢性小剂量受众远期医学效应评价的重要指标,是最直接反映辐射损伤的检查项目之一［1,2］。而细胞遗传学研究的对象是活的细胞, 其手工操作复杂、中间环节多、培养时间长, 易受各种因素的影响, 故容易导致结果的偏离。为确保做出需要的合格的染色体涂片, 寻找适合的标本制备条件显得至关重要。本实验室根据长期的细胞遗传学工作经验,对实验的方法做如下介绍。

1 材料与方法

1.1 材料 肝素抗凝外周全血5 ml、RPMI1640培养基、秋水仙素(工作浓度20 μg/ml)、低渗液(为0.075M氯化钾)、磷酸盐缓冲液(由浓度均为1/15M的磷酸氢二钠和磷酸二氢钾以1：1体积比混合, pH值为6.8)。

1.2 方法 参照染色体畸变估算生物剂量方法(GB/T 28236-2011)及国内文献［3,4］并结合作者的实践做适当的调整。

1.2.1 接种与培养 在已消毒好备用的超净台内, 用碘伏消毒采血管的头部, 将血样轻轻混匀, 用5 ml注射器取血0.3 ml, 接种到已融化好的培养基中, 同时加入20 μg/ml秋水仙素工作液, 将培养基混匀, 置于37℃恒温培养箱中, 培养50～54 h。

1.2.2 收获 首先收集细胞, 将培养基倒入10 ml离心管中, 1000 r/min离心6 min。弃上清液, 加入低渗液8 ml, 用滴管轻打混匀, 于温箱中静置15 min。预固定：加入固定液1 ml, 轻轻混匀。以1000 r/min离心6min。固定：弃上清液,加入固定液8 ml混匀, 静置20 min, 然后以1000 r/min, 离心6 min。再次固定, 弃上清液, 加入6 ml固定液, 静置20 min,然后以1000 r/min, 离心6 min。弃上清后, 依细胞数量多少加入适量固定液, 约0.2 ml, 备用。

1.3 制片 取细胞悬液滴在备用的湿冷玻片上, 在酒精灯上过火, 写上编号。

1.4 Giemsa染色 Giemsa染液与磷酸缓冲液制成5%的工作液, 把晾干的载玻片反盖在上面(细胞面朝下), 将制备好的工作液灌满染色槽, 排出气泡, 染色20 min后用自来水冲片, 气干。

1.5 镜检 在低倍镜下寻找分散良好、长短适中的分裂相,换用油镜对其进行细致观察, 每张片计数200个分裂相。

2 结果

细胞生长良好, 分裂指数高, 能够满足分析要求, 染色体分散均匀, 着色良好, 长短适中, 两条姐妹染色体大致平行分离, 着丝粒清晰。根据每条染色体的大小和着丝粒的位置, 区分中央着丝粒染色体、亚中央着丝粒染色体和近端着丝粒染色体。健康人的每一体细胞都含有46 条染色体, 其中有22对是男女共有的, 称为常染色体, 另外1对则男女相差很大, 称性染色体。见图1。

图1 制备完成的分散良好的染色体

3 讨论

培养基和器皿的准备、采血及血量的要求、秋水仙素的使用、低渗处理以及染色等方面均可决定染色体畸变分析实验的成败, 现做如下的讨论。

①培养基的准备：培养基在每新换批号时应先与正在使用的培养基同时做平行样试验, 确认培养细胞成功后才可以批量使用。②器皿的准备：本实验室所用的载玻片清洗干净后, 要在铬酸浸泡24 h后, 洗净于蒸馏水中浸泡, 放置在冰箱中备用。根据文献, 亦有人提出酸、碱性氧化电位水清洗玻璃器皿, 效果肯定, 但制水机器较昂贵, 需根据各个实验室的实际情况决定［5］。③采血及血量要求：一定要注意消毒, 避免污染, 防止培养失败。在事故现场或到工厂体检采血, 遇到不能马上培养的情况, 在运输的过程中要注意低温保存, 又要防止冻结, 同时尽量避免震动。尽量使用真空采血管采血, 以减少溶血［6］。情况允许尽快进行培养。外周血接种培养时, 要加入合适浓度的全血。每5 ml全培养基中加入0.3 ml全血, 如过少, 细胞数目少, 最后所得分裂相少；过多,细胞数目过多, 易造成细胞营养不足死亡［7］。④秋水仙素使用：作者将秋水仙素于接种时即与标本混合, 认为这样的好处首先是接触充分, 利于秋水仙素的作用；其次, 由于秋水仙素具有细胞毒性, 高浓度其镜下表现可见细胞核及细胞质固缩, 着色深紫色, 细胞转化率低［8］, 培养前混入秋水仙素,可减少秋水仙素的浓度(建议终浓度为0.03 μg/ml)和用量,即减轻其细胞毒作用, 是提高实验效能的关键。⑤低渗处理：是实验的关键步骤, 主要是时间的把握。低渗处理时间过短会造成细胞破膜膨胀不全, 染色体分散不均, 重叠现象严重,背景不清晰；而如果是低渗处理时间过长, 会造成染色体薄弱、丢失［9］。作者的经验是低渗时间以15 min为宜。低渗后的细胞易破裂, 所以操作不要过猛。低渗处理是整个实验过程的关键, 温度对结果影响也很大, 如果是室内温度低,最好将其放置于37℃培养箱中静置。固定液一定要现用现配。⑥染色与制片：染色直接关系到制片的好坏, 染液最好现用现配。另外, 存放玻片的冰箱应避免存放酸碱, 酸碱度对制片效果有直接影响。染色的时间也要依滴片的厚薄及染液的浓度做适当调整。

综上所述, 染色体畸变分析标本制备的每个环节都很重要, 出现失误会直接影响最终制片的效果, 增加观察的难度和检验结果的偏差。因此找到适合自己实验室的实验条件,并不断完善和总结经验至关重要。另外操作规程只是室内质控的一部分, 人员的培训, 仪器设备的规范管理, 培养基及其他试剂的质量控制都很重要。

［1］ 李小芳,吕玉民.放射工作人员外周血淋巴细胞染色体畸变和微核分析.河南职工医学院学报, 2006,18(5):386-388.

［2］ 王喜爱,韩林,王平,等.放射工作人员外周血淋巴细胞微核分析.医药论坛杂志, 2008,29(4):32.

［3］ 肖正华.改良的人体外周血淋巴细胞的培养与染色体标本的制作技术.第三军医大学学报, 1994,16(6):450.

［4］ 侯艳香.人外周血淋巴细胞培养染色体制备及影响因素.检验医学与临床, 2013 ,10(7):874.

［5］ 左向华,陈建魁,金欣 ,等.酸、碱性氧化电位水替代硫酸洗液的实验研究.中国医药导报, 2007,4(22):35,41.

［6］ 杜伙芬.不同静脉采血方法对血液标本溶血的影响研究.中外医学研究, 2013,11 (23):89.

［7］ 任莉萍,李娟,潘亚丽, 等.人的外周血淋巴细胞培养及染色体制作技术.生物学通报, 2011,46(3):54.

［8］ Ranney DF.Suppression of stimulating cell activity by microtubuledisrupting alkaloids.ournal of supramolecular structure, 1976,5(3): 335-342.

［9］ 傅松滨.医学遗传学.北京：北京大学医学出版社, 2009:63-84.

Investigation on experimental conditions of chromosome aberration

CHEN Yang.
Huizhou Occupational Disease Prevention and Control Hospital, Huizhou 516008, China

Objective To investigate the experiment condition of peripheral blood lymphocyte culture for chromosome aberration analysis to obtain a good production effect.Methods In the sterile spare super clean bench, after disinfecting the needle, inoculating in the mixed culture medium, taking colchicine solution into the mixture, the culture began.Matured cells, which were collected and centrifuged, with discarding the supernatant and adding hypotonic liquid, were pre-fixed.With the repeated fixation, cells were fixed with stationary liquid, then taken into produced chromosome slides, after dyeing and air drying.Observed at low magnification, 200 mitotic cells were counted.Results Cell growth was good with high mitotic index, which met the analytic need.The dispersion, color and length of chromosome were good, and sister chromatid separation roughly paralleled, with clear centromere.Conclusion Suitable experimental conditions can make the improvement of the detection rate of chromosome aberration and the speed of reading slides, which can reflect the radiation damage timely and accurately, take care the health of radiation workers, estimate the biological dose of radiation accident to provide the basis of the diagnosis and treatment for the patient.

Chromosome aberration; Experimental conditions

2014-04-10］

516008 惠州市职业病防治院

陈洋