纳米材料在蛋白质分离中的应用

邹雪艳，董 烁，李宾杰，赵彦保

(1. 河南大学 特种功能材料重点实验室，河南 开封 475004； 2.河南大学 医学院，河南 开封 475004)

纳米材料在蛋白质分离中的应用

邹雪艳1*，董 烁2，李宾杰2，赵彦保1

(1. 河南大学 特种功能材料重点实验室，河南 开封 475004； 2.河南大学 医学院，河南 开封 475004)

蛋白质的分离技术不仅在药物检测和制药工程中具有重要意义，而且还是生化工程和蛋白质分析的一个研究热点. 纳米材料具有许多与众不同的特性，广泛应用于化工、生物、医药、航天等多个领域，被认为是21世纪最有前途的材料. 本文作者从非金属氧化物纳米材料、非金属单质纳米材料、金属氧化物纳米材料、金属单质纳米材料、纳米聚合物、纳米复合材料等方面综述了纳米材料在蛋白质分离方面的应用现状，总结了其在蛋白质分离中的优缺点，并就其在蛋白质固定和分离领域的应用前景进行了展望.

纳米材料；蛋白质分离；应用；综述

近年来，研究人员通过对不同纳米材料进行表面改性制备出了许多生物功能性材料，广泛应用于生物医药等各个领域[1-8]，尤其是应用于各种蛋白质的分离[9-10]. 蛋白质是所有生物有机体的重要组成，是一切生命的物质基础，生命体的一切代谢活动包括生长、发育和繁殖等无不与蛋白质的活性和代谢有关. 构成生物体的细胞包括不同种类的蛋白质，且每一种蛋白质具有不同的结构和功能. 要从本质揭示某一蛋白质的结构和功能，如同拆装机器零部件一样需要单一进行分析修理，因此采用综合生物化学方法来分离某种特定蛋白质对了解和揭示某一生命现象和本质有着重要的意义.

蛋白质在组织和细胞中一般都是以复杂的混合形式存在，各种不同类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，要从如此混杂和众多的蛋白质中获取目的蛋白是一项艰巨的任务，因此分离纯化的总目标应是增加制品纯度，保持分离蛋白质的生物活性，减少分离过程中的成本消耗，达到高效、低耗和优质的目的. 蛋白质分离纯化是生化工程和蛋白质分析的研究热点，近年来将纳米概念融入其中，以纳米材料为载体，对其表面进行功能化处理得到一种新型生物功能化载体材料，可广泛应用于蛋白质的分离纯化. 蛋白质分离纯化的主要方法有沉淀法[11]、层析法[12]、电学法[13]、离心法[14]、膜分离技术[15]等(见图1)，其中层析法是一种高效分离蛋白质的方法，在纳米材料作为载体的实验中应用较多. 层析法最早起源于20世纪初，1950年之后得到飞速发展，它利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果. 按照分离所依据的物理或物理化学性质的不同，层析法又分为离子交换层析、分子排阻层析、亲和层析、吸附层析等. 层析法具有以下优点：分离效率高、分离速度快、检测灵敏度高、样品用量少、选择性好，另外可以同时进行多组分分析，并且可以实现从进样到数据处理的全自动化操作. 但是层析法的定性分析能力较差，一般需要与其他具有定性分析能力的分析技术联用.

图1 蛋白质分离纯化分类图Fig.1 Scheme of protein classification

1 纳米材料在蛋白质分离纯化方面的应用

1.1 非金属氧化物纳米材料

1.1.1 纳米二氧化硅粒子

在非金属氧化物纳米材料中，纳米SiO2是一种较为常用的材料，具有无毒、无味、生物相容性好、性质稳定、吸附能力强等优点，其内部为絮状或网状的无定形结构，表面有大量羟基，为各种化学反应和生物分子在其表面的结合提供了便利条件，在蛋白质分离纯化[16-20]方面发挥着越来越重要的作用.

邹雪艳等[19]在纳米二氧化硅表面修饰了氨基，再以戊二醛为交联剂进一步键合了谷胱甘肽基团，利用谷胱甘肽与谷胱甘肽S-转移酶之间的特异性吸附作用，将谷胱甘肽S-转移酶从混合蛋白中分离出来. 为了提高二氧化硅表面活性基团的接枝率，又采用巯基丙基三甲氧基硅烷一步法合成了巯基纳米二氧化硅，并在其表面进行生物功能化，用于谷胱甘肽S-转移酶的分离，分离效果较好[21]，该方法为二氧化硅生物功能化研究提供了一条新思路. 为了提高接枝率，LI等[22]利用巯基硅烷偶联剂一步水解得到纳米SiO2-SH微球，并在其表面键合了GSH分子制备了SiO2-GSH生物材料，用于分离GST蛋白. 经检测，一步法制备的SiO2-SH微球表面巯基含量达387.4 μmol/g，可以有效的从混合蛋白质纯化分离GST.

1.1.2 介孔分子筛

介孔分子筛是一类孔径在2～50 nm之间，具有孔分布窄、孔径尺寸可调、孔道结构高度规则有序、比表面积高的无机多孔材料，在催化转化[23-24]、吸附分离[25-26]、药物传递和释放[27-29]、纳米材料制备[30-31]等领域有良好的应用前景.

1997年RAIMONDO等[32]通过溶胶-凝胶技术在介孔分子筛M41-S上固定玻璃毛细血管柱用作气相色谱的分离. 雷杰等[33]在介孔分子筛SBA-15表面嫁接二乙胺基乙基(DEAE)制成了弱阴离子交换层析剂DEAE-SBA-15，其既具有分子筛作用又具有离子交换作用，能够将粉尘螨代谢培养基中的粉尘螨主要变应原Derf2蛋白进行分离纯化，所得的Derf2仍具有变应原活性.

1.2 非金属单质纳米材料

在非金属单质纳米材料中，碳纳米管是一种研究较多的载体，能与蛋白质中的氨基、羧基官能团结合，制备多种蛋白质功能化的生物材料，应用于生物样品分析、电化学反应机理、金属粒子及有机污染物检测等领域[34-41].

JIANG等[42]将多壁碳纳米管进行羧基化形成活性酯，活性酯与铁蛋白、牛血清蛋白中的氨基反应形成酰胺键，从而将铁蛋白、牛血清蛋白键合到了多碳纳米管的表面. 此过程避免了蛋白质分子之间的相互作用，提供了一种有效连接碳纳米管与生物分子的方法. MUBARAK等[43]用碳纳米管作为载体，成功的分离纯化了脱脂物中的乳汁蛋白，优化了电泳缓冲液的pH及离子强度，并且这种碳纳米管还可以作为疏水作用色谱法的有效介质. ZHANG等[44]利用介孔二氧化硅@碳纳米管来分离细胞色素(Cyt)、牛血清蛋白(BSA)、溶菌酶(Lyz)的混合溶液，当达到细胞色素c的等电点(pH=9.6)时Cyt的吸附量达到最大值，而在BSA和Lyz的等电点附近时BSA和Lyz几乎没有被吸附. 被吸附的Cyt在高离子强度的缓冲溶液中可以重新被释放出来，并且介孔二氧化硅@碳纳米管经过处理后可以循环使用.

1.3 金属氧化物纳米材料

纳米Fe3O4、Fe2O3、TiO2、ZrO2、Al2O3、V2O5等金属氧化物纳米材料[45-46]均具有良好的生物相容性，是生物材料固定的潜在媒介，这些纳米粒子可与蛋白质的某些基团定向结合，使生物分子在其表面定向排列、取向规则，提高了固定生物材料的活性. 同时它们在蛋白质的分离纯化中也发挥了极其重要的作用.

HSIEH等[47]将TiO2纳米材料分散在聚乙二醇体系中，并连接到毛细管内壁，用于分离血管紧张素类型的寡肽，平均柱效为3.1×104塔板/m，证实了TiO2纳米材料在蛋白质毛细管电泳中的突出应用. XU等[48]在磁性Fe2O3表面偶联多巴胺分子，用于对6×His标签蛋白的分离纯化，这种磁性纳米颗粒具有高度的专一性，并可回收再利用(见图2). ZOU等[49]以FeCl3为载体，采用一步水热法制备了Fe3O4/Cys复合材料，然后在其表面吸附了Ni2+得到Fe3O4/Cys-Ni2+生物材料，并用其进行His-tagged蛋白的分离，经检测对His-tagged蛋白的分离能力达到53.2 mg·g-1.

(A)磁性纳米微粒特异性吸附六组氨酸；(B)回收的磁性纳米颗粒重复利用的电泳图

1.4 金属单质纳米材料

纳米金、银、铜等金属单质纳米颗粒具有比表面积大、吸附能力强、生物相容性好等优点，可将生物分子强有力地固定在其表面制得生物传感器或者其他器件[50-53]，并在蛋白质的分离纯化中也取得广泛应用[54-57]. 由于其具有表面效应及量子尺寸效应，通过静电吸附或巯基修饰位点进行共价耦合，金纳米棒表面容易被抗体、寡核苷酸、生物素、蛋白A、外源凝集素、酶等关键探针分子功能化，这种生物分子纳米粒子杂化体系对于生物传感、靶向药物及基因运送、光热治疗以及生物材料成像而言都是基础的构建元[58].

YU等[55]在双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)表面覆盖了纳米金颗粒，用于分离酸性和碱性蛋白质，该方法操作简单、分离效率高、重现性好(见图3). 刘倩等[56]在前人基础上用双子表面活性剂保护的金纳米颗粒作为毛细管电泳缓冲添加剂应用于复杂样品(血浆、血红细胞和鸡蛋清等)中蛋白质的分离，纳米金的加入能够缩短分析时间，并能辅助提高分离效率，在蛋白质分离中具有较好的应用前景.

图3 DDAB与金纳米颗粒及蛋白质结合示意图Fig.3 Schematic diagram suggesting the reaction between DDAB, Au and protein

1.5 纳米聚合物

纳米聚合物具有许多不同于原子和分子，也不同于宏观物品的性质，在高科技领域中应用广泛，其应用已渗透到化学、生物学、光学、磁学、机械学、功能材料科学等多个领域[59-62]. KLEINDIENST等[63]将单层氯甲基化聚苯乙烯纳米材料(40～140 nm)永久吸附在毛细管内壁上，用于分离蛋白质或多肽. 在pH=3.1时，不利的吸附由于电荷的排斥作用被抑制，目标蛋白分离效果明显，最高分离效率达到400 000塔板/米. HUBER等[64]在上述基础上用蚁酸或醋酸滴定氨的方式调节pH，使毛细管电泳能直接与电喷射离子化质谱偶联，用于分离β-乳球蛋白A、β-乳球蛋白B和α-乳白蛋白. 李永等[65]以阳极氧化铝膜(AAO)为载体，以蛋白质为印迹分子，合成了表面印迹纳米线聚合物，解决了印迹蛋白难以洗脱的问题. 该聚合物对牛血红蛋白(BSA)具有特异性结合能力，并且具有较高的吸附容量. 当印迹纳米线结合50%蛋白时，空白纳米线仅结合6.8%的蛋白.

此外，甲壳素、壳聚糖等因其资源丰富、易表面修饰、生物相容性好等特点，近年来也广泛应用于BSA、甲壳素结合蛋白、凝聚素以及酶蛋白等[66]的分离纯化.

1.6 纳米复合材料

随着纳米技术的日益发展，单一的纳米材料已不能满足市场的需求，近年来很多学者致力于纳米复合材料的合成与应用. 磁性粒子在外界磁场存在下能定向运动，在生化分离中具有重要应用. 朱晶晶等[67]将还原型谷胱甘肽(GSH)共价结合在异硫氰酸根末端磁性微粒表面，并以其为载体建立了GST融合蛋白纯化体系. 结果表明10 mg磁性微粒可满足100 μL细胞裂解液体系中目标蛋白的纯化，对GST融合蛋白的平均纯化量为516 μg. BAE等[68]在二氧化硅纳米管表面修饰了金纳米颗粒(Au-MSNT)，再以金纳米颗粒为桥梁，将纳米管表面的巯基与半胱氨酸中的巯基连接起来，从来实现分离半胱氨酸及含有半胱氨酸片段的其他蛋白.

2 展望

随着人们对纳米材料的不断深入研究，将会有越来越多纳米材料被生物功能化，用于蛋白质的分离纯化及其他生物医学领域，并最终成为蛋白质分离、生物制药、医学检测、医学成像等方面的主力军. 但目前的许多应用研究还较为初步，仅局限于实验室，许多技术达到工业化生产还有一定的距离，还有许多问题需要解决和深入研究.

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[责任编辑：毛立群]

Applicationofnanometermaterialsinproteinseparation

ZOU Xueyan1*, DONG Shuo2, LI Binjie2, ZHAO Yanbao1

(1.KeyLaboratoryforSpecialFunctionMaterials,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China；
2.MedicalCollege,Henanuniversity,Kaifeng475004,Henan,China)

The technology of quantitative separation of proteins is of great importance to drug testing and pharmaceutical engineering, and it has become one of the hotspots in biochemical engineering and protein analysis. With many special properties different from those of bulk materials, nanometer materials have been widely applied in chemical industry, biology, medicine, space industry and so on, and they are considered to be the most promising materials in 21st century. This review mainly focuses on the application of nanometer materials in protein separation in the past decades, covering nonmetal oxide, nonmetal, metal oxide, metal, nanometer polymer, and nanoscale composites. The advantages and disadvantages of these nanometer materials and their application status are summarized. Besides, the application prospect of nanometer materials in protein immobilization and separation is proposed.

nanometer material; protein separation; application; review

2014-02-19.

河南省科学技术重点研究项目(14B150003)，国家自然科学基金(21271062).

邹雪艳(1981-)，女，实验师，研究方向为纳米材料的制备及在生物分离方面的应用.*

，E-mail: zouxy182838@163.com.

O 613

A

1008-1011(2014)05-0544-07

10.14002/j.hxya.2014.05.020