一株GPV的分离鉴定及致病性研究

饶桂波，邵洪泽，胡桂学，吴健敏*

(1.广西兽医研究所，广西 南宁 530001；2.吉林省兽医科学研究所，吉林 长春 130062；3.吉林农业大学，吉林 长春 130118)

一株GPV的分离鉴定及致病性研究

饶桂波1，邵洪泽2，胡桂学3*，吴健敏1*

(1.广西兽医研究所，广西 南宁 530001；2.吉林省兽医科学研究所，吉林 长春 130062；3.吉林农业大学，吉林 长春 130118)

为了确定导致吉林省某地区10日龄雏鹅发病的病原，从病死雏鹅的肝脏中分离到一株病毒，根据病毒的电镜照片，动物回归试验及PCR鉴定，确定为鹅细小病毒。PCR产物测序后经BLAST比对显示，分离毒株与NCBI收录的GPV VP3基因同源性均在92%以上，与GPV/CH/HLJ02/08 VP3基因的同源性最高，达99%。致病性研究表明，分离株的ELD50为10-6.5/0.2 mL，毒力较强，且该毒株能被GPV标准血清所中和。

鹅细小病毒；分离鉴定；致病性

小鹅瘟是由鹅细小病毒(Goose parvirus，GPV)引起的雏鹅的一种急性或亚急性的败血性传染病，病毒主要侵染鹅的肠部，患病鹅主要表现为出血性、纤维素性和渗出性肠炎，发病后期能形成肠内栓塞。该病毒主要侵害3周内的雏鹅和雏番鸭，具有传播快、死亡率高的特点，发病耐过的雏鹅和番鸭表现为生长发育迟缓[1]。1956年我国学者方定一首先发现了该病，十多年后许多欧洲国家发现该病并报道称为Derzsy's病，后确定该病的病原体为鹅细小病毒。自此以后许多国家都报道了鹅细小病毒病的发生和流行[2-3]。

2011年5月吉林省某养鹅场10日龄吉林白鹅大批死亡。询问得知雏鹅和种鹅均未接种过小鹅瘟疫苗或抗小鹅瘟血清。病鹅死前腹泻严重，粪便呈绿色，濒死期角弓反张。剖检见小肠内有栓子，切面轮层状。采集病料后经实验室诊断为鹅细小病毒病。

1 材料与方法

1.1 病料采集

无菌采集吉林省某地区送检的病死鹅肝脏。

1.2 试验鹅胚及雏鹅

无GPV母源抗体的鹅胚和10日龄雏鹅，购自吉林省农业科学院畜牧分院。

1.3 培养基的制备

按常规方法制普通琼脂平板、马丁琼脂平板、巧克力琼脂平板、麦康凯琼脂平板。

1.4 主要试剂

高免血清和GPV JLDA株由吉林省兽医科学研究所赠送；Taq DNA Polymerase、dNTPs、100 bp DNA Ladder等，购自宝生物公司。

1.5 PCR引物

根据GenBank上鹅细小病毒VP3基因设计合成引物，P1：5'-ATAAGCGCC TTTCACAGC-3'；P2：5'-AAC GCA GGA TCA GAC GAA-3'

1.6 细菌的分离培养

取病死鹅的肝组织分别无菌接种LB普通琼脂平板、马丁琼脂平板、巧克力琼脂平板、麦康凯琼脂平板，37 ℃培养24 h，观察细菌生长情况。

1.7 病毒的分离培养

采集病死鹅肝脏，经常规处理后，经尿囊腔接种发育良好的12日龄鹅胚，0.2 mL/枚，10枚/组。对照组接种无菌生理盐水。37 ℃培养，每隔8h观察鹅胚生长情况。去除24 h内死亡的鹅胚，无菌收集24 ～120 h之间死亡鹅胚尿囊液，冷冻保存备用，并连续传5代。

1.8 雏鹅回归试验

检测无母源抗体的1日龄雏鹅，随机分为2组，10只/组。第1组肌肉接种分离毒株尿囊液；第2组接种生理盐水作对照组，0.2 mL/只。两组雏鹅均分别隔离饲养观察。

1.9 分离毒株电镜观察

取出现病变的鹅胚尿囊液，1 000 r/min 离心10 min，上清液置于铜网上，2%磷钨酸负染1～2 min，于JME2100EA Ⅲ(日本)透射电镜观察并照相。

1.10 PCR检测

以提取的分离毒和标准毒的核酸为模板，采用50 μL反应体系：在0.5 mL反应管中依次加10×Buffer 5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、灭菌双蒸水35 μL、2 U/μL Taq酶1 μL、20 pmol/μL上游引物、下游引物各1 μL、模板5 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；94℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 40 s，30个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。扩增片段经琼脂糖凝胶鉴定后，送宝生物公司测序。

1.11 分离株ELD50 的测定

收获的稳定毒株作10倍梯度稀释后，经尿囊腔分别接种12日龄鹅胚，每个稀释度接种10枚，0.2 mL/枚，共10组。同时设无菌生理盐水对照组。接种后继续孵化，弃24 h内死亡的鹅胚。统计24 ～120 h内鹅胚死亡情况，按Reed-Muench法计算ELD50，并剖检死亡鹅胚观察病变情况。

1.12 雏鹅保护试验

取1日龄雏鹅40只，随机分为4组。第1组肌肉注射特异性高免血清，1 mL/只，24 h后用分离株尿囊液经肌肉注射攻毒，0.2 mL/只；第2组不注射特异性高免血清，24 h后同样用分离株尿囊液经肌肉注射攻毒，0.2 mL/只；第3组肌肉注射特异性高免血清，0.2 mL/只；第4组无菌生理盐水作对照组，0.2 mL/只。4组试验雏鹅均隔离饲养观察。

1.13 鹅胚中和试验

取12日龄鹅胚40枚，随机分为4组。第1组将收获的标准株尿囊液作1∶10稀释，与高免血清等体积混合后，37 ℃感作1 h；第2组将分离株传代尿囊液作1∶10稀释，与高免血清混合液37 ℃感作1 h；第3组为高免血清；第4组为无菌生理盐水对照组。各组鹅胚均经尿囊腔接种，0.2 mL/枚，接种后继续孵化，观察鹅胚死亡情况。

2 结 果

2.1 细菌分离培养结果

无菌取剖检的病死鹅肝脏，分别划线接种于制备好的各种培养上，进行细菌分离培养，结果均无细菌生长。

2.2 病毒分离培养结果

处理的病料取上清，无菌接种于鹅胚尿囊腔，0.2 mL/枚，结果表明，试验组鹅胚孵化至48～120 h全部死亡，对照组均未死亡，于120 h后4 ℃处死，试验结果如表1所示。

表1 病料接种鹅胚的试验结果Table 1 The experimental result of disease inoculation in goose embryos

表2 死亡鹅胚尿囊液经鹅胚接种盲传的结果Table 2 The result of death embryo allantoic fluid inoculated in goose by blind passage

取48～112 h死亡鹅胚的尿囊液，100倍稀释后，分别接种鹅胚，盲传5代。结果如表2所示，盲传至第3代后，鹅胚多于72～96 h内死亡。剖检112 h内死亡的鹅胚，见胚体、绒毛尿囊膜水肿，翼和爪末端有明显的出血点，胚头、眼两侧充血严重，喙部有点状出血。

2.3 雏鹅回归试验结果

试验组经肌肉接种分离毒株尿囊液，雏鹅的感染及死亡情况如表3所示，接种48 h后全部发病，240 h后9只死亡。患鹅表现为食欲不振，行动迟缓，呆立不稳，喜卧，排出灰白色或黄绿色稀粪并混有气泡。剖检3～4日龄病死鹅，全身呈败血变化，肝、肾肿大，胰腺肿大呈淡黄色，泄殖腔扩张。4～10日龄死亡雏鹅的小肠粘膜脱落，凝固，剖开回盲部见有灰白色栓子，质地坚硬。胆囊膨大充满胆汁，肝脏呈黄色，心冠状脂肪有针尖大小点状出血。对照组雏鹅健康，未出现临床症状。

表3 雏鹅攻毒回归试验结果Table 3 The result of regression test for Goslings attacked by virus

2.4 电镜观察结果

死亡鹅胚尿囊液进行磷钨酸负染后，电镜观察， 可见病毒粒子直径约20 nm，无囊膜，具有细小病毒的特征，如图1所示。

图1 电镜观察结果Fig.1 The result of the electronmicroscopy

2.5 PCR鉴定结果

PCR扩增产物电泳后，在紫外灯下观察到1条约430 bp的特异性条带，与预期的目的片段大小相符(图2)。

图2 PCR产物电泳结果1.DL2000 DNA Marker；2.病料；3.病毒尿囊液；4.阴性对照；5.阳性对照Fig.2 The results of electrophoresis of PCR products 1.DL2000 DNA Marker; 2.Diseased;3.Virus allantoic fluid;4.Negative control;5.Positive control

2.6 PCR产物测序结果分析

将PCR扩增片段的序列在GenBank中进行BLAST比对，与GPV VP3基因同源性均在92%以上。其中与2008年黑龙江分离的GPV/CH/HLJ02/08 VP3基因同源性最高达99%，与2004年法国分离的GPV D146/02 VP3基因同源性最低但是也能达到达92%。表明本试验分离毒株为鹅细小病毒，命名为GPV/CH/JLTP/05/11株。对近年来GenBank上录入的所有GPV基因序列进行比对，制作遗传进化树结果如图3所示。

遗传进化树分析显示目前流行的GPV毒株有两个关系较近的基因群，本研究分离毒株与GPV/CH/ HLJ02/08 VP3所在群关系较近。GPV/CH/JLTP/05/11株基因片段与黑龙江和吉林的地方株VP3序列比对发现，与GPV/CH/HLJ02/08(99%)关系较近，而与吉林省地方分离株型JLDA株(96%)的关系反而较远。对三个序列比较后，用DAMBE软件分析位点变化率，结果见图4，集中于351 nt处，为变异的高频位点。

2.7 分离株ELD50测定

取分离毒株尿囊液10倍梯度稀释后，接种于12日龄鹅胚，统计24 h～120 h内死亡情况，如表4所示，经Reed-Muench法计算ELD50，分离株的ELD50为10-6.5/0.2 mL。

2.8 雏鹅保护试验结果

雏鹅注射高免血清后，经肌肉接种分离株，结果发现，第1组攻毒后观察10 d全部存活，且无明显临床症状。不注射特异性高免血清第2组攻毒后观察10 d全部死亡，死前有肠炎症状，死后解剖有小鹅瘟特征性病变，如图5所示；仅注射特异性高免血清的第3组及注射无菌生理盐水的4组观察10 d全部存活，且无明显临床症状。

2.9 鹅胚中和试验结果

分离株尿囊液10倍稀释，与高免血清混合液感作后经尿囊腔接种12日龄鹅胚，结果发现各组鹅胚120 h全部存活，鹅胚无病变。

图3 JLTPVP3基因进化树分析结果Fig.3 The results of JLTP strain VP3 gen Phylogenetic analysis

表4 JLTP分离毒株ELD50测定结果Table 4 The determination results of ELD50 isolated from JLTP

图4 位点变异率Fig.4 Substitution rates over sites

图5 病死雏鹅形成肠内栓塞物Fig.5 Intestinal embolus for dead goslings

3 讨 论

本试验经病毒分离、电镜负染尿囊液观察、动物回归试验、PCR检测、中和试验结果表明，所分离的病毒为GPV，由此确诊吉林某地发生的疫情为小鹅瘟。通过对所得的目的基因的Blast比较、遗传进化树分析结果表明：分离到的GPV与2008年分离的黑龙江度GPV/CH/HL J02/08 VP3基因同源性最高，达99%。而与吉林省兽医科学研究所2004年分离的地方株型JLDA株同源性相对较差，96%。产生这一差异这可能是由于近年吉林省养鹅效益好，导致养殖数量激增，从黑龙江省引种带入该毒株。因此提醒广大养鹅业户，应及时接种小鹅瘟疫苗或高免血清，防止本病流行的同时，注意引进雏鹅的检疫，以及科学化的饲养管理。

研究分离株的致病性，其ELD50为10-6.5/0.2 mL，毒力较强。分毒鹅胚尿囊液经盲传后，仅到第三代毒力已趋稳，这表明该毒株在吉林某地区应该存在一段时间了，且毒力有增强趋势。GPV仅有一个血清型[4]，经鹅胚中和试验和雏鹅保护性试验发现，该毒株能被标准株高免血清中和，表明其血清型没有改变，但病毒基因分析有两个相近群，未来依然要加强病毒血清型的监测。

根据流行病学，结合临诊症状和特有的病理变化可对小鹅瘟进行初诊断，确诊需进行病毒分离，病毒中和试验、琼脂扩散试验和ELISA试验[5-7]检查血清中特异性抗体，从而判断未免疫鹅群感染过或正感染鹅细小病毒，而PCR检测技术更具有敏感性和特异性的特点，能够准确检测病原[8-10]。GPV的防控主要从管理、预防和治疗三个方面着手。目前的防治小鹅瘟的有效方法，一是接种疫苗，二是采用高免卵黄液或血清进行紧急预防和治疗。种鹅接种GPV疫苗后能产生中和抗体，并经卵黄传给雏鹅，使其获得天然被动免疫，从而抵抗GPV的侵袭。需要注意的是种鹅免疫GPV疫苗后，产生的母源抗体将会影响雏鹅活疫苗的免疫效果，应进行母源抗体检测，选择合适的时间进行GPV疫苗免疫。

[1]方定一,王永坤,郑玉美,等.小鹅瘟病原体及其特异性防治的研究[J].中国农业科学,1981(1)：1-8.

[2]Kozdruń W,Wozniakowski G,Samorek-Salamonowicz E,et al.Viral infection in goose flocks in Poland[J].Polish Journal of Veterinary Sciences,2012,15(3):525-30.

[3]Irvine R,Ceeraz V,Cox B,et al.Goose parvovirus in Great Britain[J].Veterinary Record,2008,163(15): 461.

[4]Shien J H,Wang Y S,Chen C H,et al.Identification of sequence changes in live attenuated goose parvovirus vaccine strains developed in Asia and Europe[J].Avian Pathology,2008,37(5): 499-505.

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[6]Yang J L,Cheng A C,Wang M S,et al.Development of a fluorescent quantitative real-time polymerase chain reaction assay for the detection of Goose parvovirus in vivo[J].Virology Journal,2009(6): 142.

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Isolation，IdentificationandPathogenicityofaStrainofGPV

RAO Gui-bo1,SHAO Hong-ze2,HU Gui-xue3*,WU Jian-min1*

(1.GuangxiVeterinaryResearchInstitute,NanningGuangxi,530001,China;2.JilinInstituteofVeterinaryScience,ChangchunJilin,130062,China; 3.JilinAgriculturalUniversity,ChangchunJilin,130118,China)

A strain of Goose parvirus isolated from the livers of dead goslings in an area of Jilin province was identified to be the pathogen of the 10-day-old goslings disease based on its electron micrograph,animal regression test and PCR results.A comparison through BLAST showed that the VP3 gene of the isolated strain had a homology of more than 92% with those of the GPV included in NCBI and a highest homology with those of GPV/CH/HLJ02/08,which was up to 99%.Pathogenicity research on it showed that its ELD50is 10-6.5/0.2 mL,a very strong virulence.And the strain can be neutralized by standard serum of the GPV.

goose parvirus; isolation and identification; pathogenicity

2013-08-15，

2013-09-24

饶桂波(1987-)，男，安徽阜阳人，硕士，研究方向：动物病毒学。E-mail:raoguibo@126.com

*[通讯作者]吴健敏(1963-)，女，福建福州人，博士，研究员，博士生导师，研究方向：分子病毒学与传染病学。E-mail:wu-jm20@163.com胡桂学(1963-)，男，吉林长春人，博士，教授，博士生导师，研究方向：动物微生物学与免疫学。E-mail:huguixue901103@163.com

S811.6

A

1005-5228(2014)01-0049-05