雷帕霉素对缺氧条件下Hep-2细胞增殖及VEGF、HIF-1α表达的影响

张军辉,严家芹,赵玉林

1)郑州大学第三附属医院耳鼻咽喉科 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院肿瘤科 郑州 450052 3)郑州大学第一附属医院耳鼻咽喉科 郑州 450052

雷帕霉素对缺氧条件下Hep-2细胞增殖及VEGF、HIF-1α表达的影响

张军辉1)△,严家芹2),赵玉林3)

1)郑州大学第三附属医院耳鼻咽喉科 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院肿瘤科 郑州 450052 3)郑州大学第一附属医院耳鼻咽喉科 郑州 450052

△男，1978年1月生，博士，主治医师，研究方向：耳鼻喉科基础和临床，E-mail:zhangjunhui777@126.com

喉癌；缺氧；雷帕霉素；Hep-2；HIF-1α；VEGF

目的：探讨雷帕霉素对缺氧条件下人喉癌Hep-2细胞增殖及VEGF、HIF-1α表达的影响。方法在缺氧条件下，采用MTT法检测0、5、10、20 nmol/L雷帕霉素处理12、24、36、48、60、72 h后Hep-2细胞的增殖活性，ELISA检测0、5、10、20 nmol/L雷帕霉素处理24 h细胞培养上清液VEGF蛋白含量的变化，Western blot检测0、5、10、20 nmol/L雷帕霉素处理16 h细胞HIF-1α蛋白表达的变化。结果缺氧条件下雷帕霉素对Hep-2细胞仍具有明显的增殖抑制作用，且呈浓度和时间依赖性(F浓度=253.132，F时间=213.945，P<0.05)。缺氧条件下雷帕霉素可抑制Hep-2细胞VEGF的分泌及HIF-1α蛋白的表达(F=7.045、16.218，P<0.05)。结论雷帕霉素可抑制缺氧条件下Hep-2细胞的增殖，其机制可能与抑制Hep-2细胞VEGF的分泌及HIF-1α蛋白的表达有关。

喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC)是头颈部最常见的肿瘤之一。虽然近几十年来传统的喉癌治疗方式已有很大提高，但喉癌患者总的生存率仍然很低。局部区域复发、颈淋巴结转移和远处转移等是影响患者预后的主要因素[1]。喉癌的综合治疗已成为一种治疗趋势。化疗对喉腔解剖结构和喉生理功能的保护作用使其在喉癌的治疗中有着重要的意义，因此寻找高效、低毒的抗喉癌药物十分重要[2]。该实验观察了缺氧条件下mTOR信号通路抑制剂雷帕霉素对人喉癌Hep-2细胞增殖的影响；同时检测了雷帕霉素作用后Hep-2细胞VEGF的分泌和HIF-1α蛋白表达的变化，探讨雷帕霉素用作抗喉癌药物的可能性及机制。

1 材料与方法

1.1材料人喉癌Hep-2细胞株购自南京凯基生物有限公司。RPMI 1640培养液购自杭州吉诺生物医药技术有限公司，胎牛血清购自杭州四季青工程材料有限公司，噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)等试剂购自美国Sigma公司，HIF-1α和β-actin多克隆抗体购自Santa Cruz公司，辣根过氧化酶标记物山羊抗小鼠IgG(二抗)购自北京中杉金桥生物技术服务有限公司。ELISA试剂盒购自南京凯基生物有限公司。雷帕霉素购自美国Sigma公司，溶于RPMI 1640培养基制成10 μmol/L的母液，过滤除菌后-20 ℃备用。

1.2细胞培养Hep-2细胞接种于含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中(每mL含青霉素和链霉素各100 U)，置于37 ℃、体积分数为5% CO2、饱和湿度培养箱中培养，每2 d换液1次，取对数生长期细胞用于实验。

1.3不同浓度的雷帕霉素作用不同时间对缺氧条件下Hep-2细胞增殖的影响消化收集对数生长期细胞，用含体积分数10%胎牛血清的培养液调整细胞密度为7.5×104个mL-1，按100 μL孔-1接种于96孔板。待细胞贴壁后分为5组，实验组加入雷帕霉素终浓度为5、10、20 nmol/L的培养基，每个浓度设6个复孔，另设阴性对照(0 nmol/L)和空白对照(调零孔)各6个复孔。将96孔板置于缺氧培养盒(体积分数1%O2、5%CO2和94%N2，37 ℃)中继续培养12、24、36、48、60、72 h后终止。终止前4 h每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，放回培养箱内继续培养4 h后小心吸弃培养上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min，用酶联免疫检测仪在570 nm处测各孔吸光度值(A值) ，计算增殖抑制率。增殖抑制率=(阴性对照组A值-实验组A值)/阴性对照组A值×100%。

1.4不同浓度的雷帕霉素对缺氧条件下Hep-2细胞分泌VEGF的影响消化收集对数生长期细胞接种于培养瓶内，细胞贴壁后弃原培养液，PBS冲洗3遍。加入雷帕霉素终浓度为0、5、10、20 nmol/L的无血清培养基，缺氧培养盒中培养24 h后取培养上清液，1 000 r/min离心5 min，-80 ℃冻存备用，计数细胞。将样品和标准品按100 μL/孔加入酶标板，37 ℃反应120 min。加生物素标记抗体，再加入抗人VEGF抗体工作液, 100 μL/孔，37 ℃反应60 min。加亲和素-过氧化物酶复合物ABC，100 μL/孔，37 ℃反应30 min。加入终止液，100 μL/孔，37 ℃反应25 min。在酶标仪上测定各孔A450 nm值。实验重复3次。

1.5不同浓度的雷帕霉素对缺氧条件下Hep-2细胞HIF-1α蛋白表达的影响消化收集对数生长期细胞接种于6孔板上，培养至细胞间接近融合，加入雷帕霉素终浓度为0、5、10、20 nmol/L的培养基，于缺氧培养盒中培养16 h，提取细胞总蛋白。总蛋白浓度经Bio-Rad测定后经SDS/PAGE凝胶电泳，然后转移至PVDF膜上。封闭后加HIF-1α一抗(按1:200稀释)4 ℃过夜。经TBST漂洗后加入稀释的二抗，室温孵育2 h后荧光显色，曝光、显影和定影。扫描蛋白印迹胶片，以β-actin为内参计算各组细胞目的蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.6统计学处理采用SPSS 13.0处理数据。采用3×6析因设计的方差分析比较不同浓度和不同作用时间组间增殖抑制率的差异，采用单因素方差分析比较不同浓度组间Hep-2细胞VEGF与HIF-1α 蛋白表达的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1不同浓度的雷帕霉素作用不同时间对缺氧条件下Hep-2细胞增殖的影响见表1。由表1可见，雷帕霉素对Hep-2细胞增殖有抑制作用，且呈浓度和时间依赖性。

表1 缺氧条件下不同浓度的雷帕霉素作用不同时间Hep-2细胞的增殖抑制率(n=6) %

F浓度=253.132，F时间=213.945，F交互=9.367，P均<0.001。

2.2缺氧条件下不同浓度的雷帕霉素对Hep-2细胞分泌VEGF及HIF-1α蛋白表达的影响见表2，图1。

表2 缺氧条件下不同浓度的雷帕霉素对Hep-2细胞分泌VEGF及HIF-1α 蛋白表达的影响(n=3)

图1 雷帕霉素对缺氧诱导的Hep-2细胞HIF-1α 蛋白表达的影响

1: 0 nmol/L雷帕霉素;2: 5 nmol/L雷帕霉素;3: 10 nmol/L雷帕霉素;4: 20 nmol/L雷帕霉素。

3 讨论

实体肿瘤发展过程中的一种普遍现象是缺氧，为肿瘤细胞异常增生导致供氧与耗氧比例失衡所致。缺氧使肿瘤的生物学行为发生改变，表现为恶性程度增高，侵袭性增强，更易转移和复发，放化疗的敏感性差等方面[3]。近年的研究[4]表明AKT/mTOR信号通路在喉癌组织中高表达，在喉癌发生发展中起着重要作用。Akt/mTOR信号通路活化后可以通过抑制细胞凋亡，拮抗细胞周期阻滞，促进肿瘤血管生成、侵袭及转移参与肿瘤的发生发展[5]，呈浓度和时间依赖性。该实验结果显示缺氧条件下随mTOR信号通路抑制剂雷帕霉素浓度增加、作用时间延长，Hep-2细胞的增殖抑制率逐步升高。

由于肿瘤细胞的快速生长，肿瘤细胞经常处于氧缺乏环境中，因而血管生成就显得尤为重要[6]。新生的肿瘤血管在肿瘤发生发展及侵袭和转移过程中都扮演着十分重要的角色。肿瘤血管的生成是促血管生成因子和抗血管生成因子之间的平衡异常导致。VEGF为促血管生成因子，是抑制肿瘤血管生成的主要靶基因[7]。该研究结果显示，雷帕霉素作用于缺氧条件下的喉癌Hep-2细胞24 h后，细胞培养上清液中VEGF蛋白的表达随着雷帕霉素浓度的增加呈下降的趋势，提示雷帕霉素可能通过下调缺氧诱导的VEGF蛋白的表达来阻滞喉癌新生血管形成。

HIF-1α是人体在缺氧条件下广泛表达的一种转录因子。在常氧情况下，HIF-1α易被蛋白水解酶降解，在细胞中基本检测不到，然而在缺氧状态下细胞HIF-1α蛋白不被降解且成倍增加，增加的HIF-1α在缺氧调控的生理病理过程中起着重要作用[8-9]。有研究[10]表明HIF-1α在喉癌组织中高表达并与喉癌新生血管的形成密切相关。该研究结果显示，雷帕霉素作用于缺氧条件下的喉癌Hep-2细胞16 h后，细胞中HIF-1α蛋白的表达随雷帕霉素浓度的增加呈下降的趋势，提示雷帕霉素可能通过下调缺氧诱导的HIF-1α蛋白的表达来抑制VEGF的表达。

综上所述，雷帕霉素可抑制Hep-2细胞增殖，其机制可能与抑制缺氧诱导的Hep-2细胞VEGF的分泌，下调HIF-1α蛋白的表达有关。该研究为雷帕霉素用于喉癌的治疗提供了一定的理论基础。

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(2014-03-17收稿 责任编辑徐春燕)

Effects of rapamycin on proliferation of hypoxia-induced laryngeal cancer Hep-2 cells and expressions of VEGF and HIF-1α

ZHANGJunhui1)，YANJiaqin2)，ZHAOYulin3)

1)DepartmentofOtorhinolaryngology，theThirdAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)DepartmentofOncology，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 3)DepartmentofOtorhinolaryngology，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

laryngeal carcinoma; hypoxia; rapamycin; Hep-2; HIF-1α; VEGF

Aim: To study the effect of rapamycin on the proliferation of hypoxia induced laryngeal cancer Hep-2 cells and the expressions of VEGF and HIF-1α. Methods: MTT was used to observe the proliferation of Hep-2 cells treated with 0,5,10,20 nmol/L rapamycin for 12,24,36,48,60,72 h under hypoxia environment. ELISA was used to determine the content of VEGF in cell culture supernatant after 0,5,10,20 nmol/L rapamycin treatment for 24 h. Western blot was used to detect the expression of HIF-1α in the cells after 0,5,10,20 nmol/L rapamycin treatment for 16 h. Results: Rapamycin could inhibit the proliferation of Hep-2 cells in a dose-dependent and time-dependent manner under hypoxia(Fconcentration=253.132,Ftime=213.945,P<0.05), significantly decrease the content of VEGF in Hep-2 cell culture supernatant and the expression of HIF-1α protein(F=7.045,16.218,P<0.05). Conclusion: Rapamycin could inhibit the proliferation of Hep-2 cells under hypoxia environment, which may be involved in its inhibiting the secretion of VEGF and decreasing the expression of HIF-1α.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.06.025

R739.65