mytoxin B和myrothecine A抑制肝癌细胞SMMC-7721增殖的分子机制

徐化洁, 吕丰伟, 程文婷, 刘明艳,张 瑾, 申 丽, 傅 奕

(扬州大学医学院, 1. 09级临床本科; 2. 生物化学教研室; 3. 药学教研室, 江苏 扬州, 225001)

生物毒素作为一类特殊的天然产物，因其高生物活性、对特定靶位的高度选择性和作用靶位及作用机制的多样性等特点引起科研人员的高度关注。目前很多生物毒素得到研究，并成功开发应用于临床，如长春花碱、喜树碱等植物毒素，生物毒素已成为抗肿瘤新药的重要来源[1-2]。

单端孢霉烯大环内酯是漆斑菌Myrothecium sp.、毛壳菌Chaetomium sp.、黑色葡萄状穗菌 Stachybotrys sp.、拟茎点霉菌 Phomopsis sp. 等真菌产生的一类真菌毒素，是单端孢霉烯的4β和15位二酰化后形成的大环内酯，具有丰富的结构类型和显著的抗肿瘤活性[3-6]，特别是非大环类似物单端孢霉烯anguidine曾进入二期临床研究[7-8]。早期研究[9]表明，单端孢霉烯及其大环内酯通过抑制肿瘤细胞蛋白质合成而发挥强抗肿瘤作用，而这正是他们产生毒性的主要原因。因此，研究单端孢霉烯大环内酯的抗肿瘤分子机制，对其化学结构修饰与改造以提高活性和靶向性、降低毒性非常关键。单端孢霉烯大环内酯作为抗肿瘤活性物质得到广泛研究[10-11]，但抗肿瘤机制文献报道较少[12]。

mytoxin B和myrothecine A是从黄花蒿内生真菌 M. roridum IFB-E012发酵液中分离获得的单端孢霉烯大环内酯化合物[5], mytoxin B分子结构的倍半萜部分含有12,13-环氧环，myrothecine A为mytoxin B的10,13-碳环单端孢霉烷衍生物(10,13-碳环衍生物目前只在共生菌中发现[14-15])。文献[13]表明，12,13-环氧环对单端孢霉烯大环内酯的抗肿瘤活性影响显著。为在分子水平揭示12,13-环氧环对抗肿瘤活性的影响，本文以肝癌细胞SMMC-7721为研究对象，观察mytoxin B和myrothecine A对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用，并初步探讨了分子机制，为进一步抗肿瘤机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 药品及试剂

mytoxin B和myrothecine A为本课题组分离提取[5]，用10%二甲亚砜(DMSO)配成1 mg/mL浓度存储液备用。细胞培养所用高糖DMEM为GIBCO公司产品，小牛血清购自山东银香伟业公司。小鼠抗人p27单克隆抗体(F-8)为Santa Cruz产品，小鼠抗人GAPDH单克隆抗体购自上海康成生物公司，辣根过氧化酶标记的羊抗小鼠二抗购自北京博士德公司。质粒pSi-p27-469及pSi-con对照质粒为本实验室构建保存[16]。

1.2 细胞培养

肝癌细胞SMMC-7721为本室保存。肝癌细胞SMMC-7721在含有10%新生牛血清的DMEM中常规培养(37 ℃, 5% CO2), 取对数生长期细胞用于实验。

1.3 质粒转染

按Invitrogen公司LipofectamineTM 2000转染说明书进行。具体方法如下：将5×105个细胞加入6孔培养板中，培养至细胞融合90%以上。平行配制转染试剂Lipofectamine的无血清DMEM稀释液(10 μL脂质体+250 μL无血清DMEM)以及质粒的无血清稀释液(质粒+250 μL无血清DMEM)。混合上述两管液体，轻轻混匀，室温静置20 min以形成DNA-Lipofectamine复合物。与此同时弃去细胞旧培养液，换以无抗无血清的DMEM 1.5 mL。将上述配制的500 μL DNA-Lipofectamine混合物加入细胞中，轻晃6孔板以混合均匀，孵育6 h后，换用含10%新生牛血清的完全培养液，继续培养。然后分别于转染后的24、48 h收集细胞，进行Western blot检测。

1.4 MTT测定细胞增殖

取加药处理的细胞，以1×104个细胞/孔接种于96孔板。接种后48 h, 每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL), 继续孵育4 h。然后弃去培养液，每孔加入150 μL DMSO, 37 ℃振荡10 min, 使结晶充分溶解，酶标仪在波长490 nm处测定各孔吸光度值。以5-氟尿嘧啶(5-Fu)为阳性对照。

1.5 流式细胞仪检测细胞周期

细胞接种于6孔板中，待生长至70%左右汇合时加药处理。48 h后，收集细胞，300目滤网过滤制成单细胞悬液, 1 500 r/min离心10 min, 弃上清。用预冷的70%乙醇固定细胞, -20 ℃固定过夜。3 000 r/min离心10 min除去乙醇，加入1 mL PBS悬浮细胞，离心。细胞计数，调整细胞浓度为1×106细胞/mL。将细胞重悬于50 μg/mL的碘化丙锭染液中(其中含RNaseA，终浓度为20 μg/mL), 37 ℃保温30 min。细胞进行流式测定，应用ModFit LT3.0软件分析细胞周期中各期细胞所占总细胞的百分率。

1.6 Western blot

取加药处理或转染后的细胞，弃去培养液，以预冷的PBS洗涤2次，加入相应体积的1×SDS蛋白裂解液，冰上放置30 min。以刮棒刮下细胞，沸水浴10 min, 然后4 ℃, 12 000 r/min离心10 min。取上清，用改良Lowry法进行蛋白定量。调整样品蛋白质浓度使其相等，保证每个样品孔蛋白上样量一致。蛋白质经SDS-PAGE后，转移至PVDF膜上。PVDF膜以5%脱脂奶粉封闭4 h后，加入一抗过夜。经洗涤后，再加入辣根过氧化酶标记的二抗，室温下反应3～4 h。每步反应结束均用PBST洗涤3次, 10 min/次。最后用ECL化学发光，经曝光、显影、定影后，胶片晾干保存，扫描后用Image J软件进行图像定量分析。

2 结 果

2.1 mytoxin B和myrothecine A对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响

SMMC-7721细胞经不同浓度的mytoxin B和myrothecine A分别作用48 h后，采用MTT法测定细胞增殖。结果发现，mytoxin B在0.1 g/mL时就可明显抑制细胞增殖，抑制率为41%，但随着浓度的增加，并未呈现出剂量依赖性; myrothecine A在浓度为0.5 g/mL时表现出抑制细胞增殖的作用，抑制率为22%, 浓度为1 g/mL时抑制作用更为明显，抑制率为38%, 并随着浓度增加呈现出剂量依赖性；而阳性对照5-Fu在5 g/mL时才明显表现出抑制细胞增殖的活性，抑制率为25%(图1)。

Compared with NC, *P<0.05, **P>0.01

2.2 mytoxin B和myrothecine A诱导肝癌细胞SMMC-7721细胞周期阻滞

细胞增殖受到细胞周期的调控，采用流式细胞仪可测定mytoxin B和myrothecine A对SMMC-7721细胞周期的影响。mytoxin B和myrothecine A在1 g/mL浓度时皆可明显抑制细胞增殖，因此，相关的机制实验均采用1 g/mL浓度的药物处理细胞。

流式细胞仪检测结果显示，与阴性对照细胞NC相比，mytoxin B和myrothecine A处理细胞后, G0/G1期的细胞比例均减少，分别为53.80%和59.73%(对照组为67.65%); 而S期的细胞比例增加，分别为46.2%和39.42%(对照组为31.30%)(图2)。上述结果提示，mytoxin B和myrothecine A都可不同程度导致S期细胞增多，即S期细胞周期阻滞，这可能是导致细胞增殖抑制的原因。

图2 mytoxin B和myrothecine A对肝癌细胞株SMMC-7721细胞周期的影响

2.3 mytoxin B和myrothecine A上调SMMC-7721细胞中p27的表达

细胞周期的运转受到许多蛋白因子的协调控制。p27是一种重要的细胞周期负调控蛋白，它可与cyclinD1/CDK4及cyclinE/CDK2复合物结合，特异性地抑制CDK2和CDK4的激酶活性，导致细胞周期阻滞，从而抑制细胞增殖[17]。为探讨mytoxin B和myrothecine A诱导S期细胞周期阻滞的机制，本文采用1 g/mL的mytoxin B和myrothecine A分别处理SMMC-7721细胞48 h后，收集细胞蛋白，用Western blot测定细胞周期负调控蛋白p27的含量。实验以未加药孔蛋白作阴性对照(NC)，GAPDH为内参。结果发现，mytoxin B和myrothecine A皆可导致p27蛋白表达明显增加，分别为阴性对照的1.6倍和1.9倍(图3)。

Compared with NC, *P<0.05, **P<0.01

2.4 p27 shRNA可部分阻断mytoxin B和myrothecine A诱导的细胞增殖抑制

为证明p27蛋白表达的上调与mytoxin B和myrothecine A诱导的细胞增殖抑制相关，本文在SMMC-7721细胞中转染pSi-p27-469质粒(pSi-p27)[16]，并以转染pSi-nonsense(pSi-con)作为对照，在转染的同时加入mytoxin B和myrothecine A处理细胞。然后分别在转染后的24、48 h收集细胞，收集的细胞一部分进行MTT测定，一部分提取蛋白进行Western blot检测。Western blot结果显示，转染24 h后，SMMC-7721细胞中的p27蛋白含量没有明显变化；而转染48 h后，p27蛋白的表达明显减少(图4)。MTT结果也显示，转染pSi-p27 24 h后，mytoxin B和myrothecine A的细胞增殖抑制作用没有受到影响；而转染48 h后, mytoxin B和myrothecine A所致的细胞增殖抑制可被逆转(图4)。在mytoxin B处理的细胞中，转染pSi-p27可使细胞增殖率恢复20%; 而在myrothecine A处理的细胞中，下调p27蛋白的表达几乎使细胞增殖抑制完全被阻断。

**P<0.01

3 讨 论

研究表明，12,13-环氧环对单端孢霉烯大环内酯的抗肿瘤作用影响显著。本文观察mytoxin B和myrothecine A对SMMC-7721细胞增殖的影响时发现，他们皆可抑制SMMC-7721细胞的增殖，但作用特点不同: mytoxin B在0.1 g/mL时就表现出明显的抑制作用，但没有剂量依赖性，提示mytoxin B的增殖抑制作用在低浓度时就可能已达饱和；而myrothecineA在0.5 g/mL浓度时具有明显抑制作用，且随着浓度的增加呈现剂量依赖性。进一步的细胞周期分析显示，mytoxin B和myrothecine A都可不同程度导致S期细胞周期阻滞，SMMC-7721细胞的增殖受到抑制。

细胞的增殖受到细胞周期的精密控制，而细胞周期运转则需要许多蛋白因子的协调控制，主要包括正性调节蛋白和抑制性调控因子[18]。细胞周期的抑制性调控因子主要指细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂(CKIs), 包括两类：一是INK4(inhibitor of CDK4)蛋白家族，一是CIP/KIP蛋白家族。p27是CIP/KIP蛋白家族的重要成员，已发现p27的蛋白表达量与肿瘤的发生、发展及预后密切相关，被看做是一种潜在的抑癌蛋白[19]。因此，本文采用Western blot测定p27蛋白的含量，以探讨mytoxin B和myrothecine A诱导的细胞增殖抑制与p27蛋白的关系。结果发现，mytoxin B和myrothecine A都可以增加p27蛋白的表达，提示mytoxin B和myrothecine A可能通过上调p27的表达诱导S期细胞周期阻滞，进而抑制SMMC-7721细胞增殖。为进一步证明该机制，本文利用p27 shRNA质粒下调p27蛋白的表达，以观察mytoxin B和myrothecine A诱导的细胞增殖抑制是否受到阻断。结果发现，在myrothecine A处理的SMMC-7721细胞中，细胞增殖的抑制几乎完全被阻断，表明myrothecine A正是通过增加p27蛋白的表达而抑制细胞增殖。而mytoxin B处理的细胞中，下调p27蛋白的表达只起到部分阻断作用，提示还有其他机制可能参与了mytoxin B引起的细胞增殖抑制，有待进一步探讨。

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