胃癌患者外周血CEAmRNA和CK20mRNA联合检测及意义

王玉文 任意 费建东 聂双发

·论著·

胃癌患者外周血CEAmRNA和CK20mRNA联合检测及意义

王玉文 任意 费建东 聂双发

目的 探讨胃癌患者外周血中CEAmRNA和CK20mRNA表达情况及临床意义。方法应用RT-PCR方法检测56例胃癌患者，20例胃良性病变患者外周血CEAmRNA和CK20mRNA。结果胃癌组，CEAmRNA及CK20m RNA的阳性率与良性组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；二者联合检测阳性率为76.8%，较单项阳性率高组差异无统计学意义(P>0.05)；肿瘤不同分化程度，组织类型，临床分期及淋巴结转移的CEAmRNA的阳性表达间差异有统计学意义(P<0.05)；不同肿瘤组织类型，临床分期及淋巴结转移CK20mRNA的阳性表达间差异有统计学意义(P<0.05)。结论联合检测有助于提高肿瘤微转移检出率，其表达与临床分期及淋巴结转移明显相关。可作预后参考指标。

胃癌；CEAmRNA；CK20mRNA；微转移

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，胃癌患者根治术后治愈率较低，而导致患者死亡的最主要原因是肿瘤的复发和转移。肿瘤微转移是复发转移的基础和前提条件。微转移指病理检查、影像学技术等方法难以检出的非血液系统恶性肿瘤播散并生存于血循环、淋巴道、骨髓及各器官组织中尚未形成转移结节的微小肿瘤细胞转移灶[1]。微转移是影响患者预后的重要因素，其检测有助于提高临床诊断，使患者及时接受手术，并可加强术后的监测，从而提高患者术后生存率。由于微转移的肿瘤细胞常以单个或微小细胞团存在，因此常规检查难以发现，肿瘤标志物的出现使微转移的检测成为可能。近年来，PCR技术的广泛应用，使该研究取得了很大进展，从而提高了胃癌患者微转移的检出率。本研究通过检测胃癌患者CEAmRNA与CK20mRNA在外周血中的表达，探讨其作为判断外周血微转移及预后的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集黄骅市人民医院2008年至2011年收治的56例胃癌患者临床病理资料，56例均行胃镜检查且病理明确为胃癌，其中男32例，女24例；年龄31～75岁，平均年龄59.7岁；分化程度：高中分化23例，低分化33例；组织学类型：腺癌29例，黏液腺癌17例，印戒细胞癌10例；肿瘤部位：贲门胃底9例，胃体20例，胃窦27例；淋巴结转移27例，29例无淋巴结转移；临床分期：Ⅰ～Ⅱ期24例，Ⅲ～Ⅳ期32例。本组患者术前未行各种治疗。胃肠道良性肿瘤20例，其中包括胃溃疡，胃平滑肌瘤，胃腺肌瘤等。

1.2 方法

1.2.1 标本采集及单个核细胞的提取：用含乙二胺四乙酸抗凝的密封试管采集清晨空腹肘前静脉血5 ml，采用密度梯度离心法，用淋巴细胞分离液提取单个核细胞，细胞计数约106～107/ml，然后再用Trizol提取液提取总RNA。

1.2.2 RT-PCR：将各反应管快速离心混匀，置PCR仪中，按反应条件：42℃孵育60 min，以mRNA为模板反转录合成第一条cDNA链，再99℃预变性5 min，灭活反转录酶，同时使杂交的RNA/cDNA变性，合成第二条cDNA链，然后进行PCR扩增各个标记物的cDNA引物序列，并用肌动蛋白作内对照。PCR产物6 μl上样于2%琼脂糖凝胶(0.5 μg/ml溴化乙锭)，电泳。

1.2.3 检测PCR产物：紫外成像仪成像并测出阳性者。

1.3 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件，计数资料比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CEAmRNA与CK20 mRNA在各组中的表达 胃癌组CEAmRNA与CK20mRNA的阳性率与良性组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 联合检测阳性率(至少一项阳性)与单项阳性率的比较 恶性组中，联合检测阳性率，与CEAmRNA及CK20mRNA单项阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，但是可以提高检出率。见表2。

2.3 CEAmRNA与CK20mRNA的表达情况与肿瘤临床病理特点的关系 患者不同性别，年龄，肿瘤位置CEAmRNA的阳性表达间差异无统计学意义(P>0.05)，肿瘤不同分化程度，组织类型，临床分期及淋巴结转移间差异有统计学意义(P<0.05)；患者不同性别，年龄，肿瘤位置，分化程度CK20mRNA的阳性表达间差异无统计学意义(P>0.04)，肿瘤不同的组织类型，临床分期及淋巴结转移间差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表1 CEAmRNA与CK20 mRNA在各组中的表达 例(%)

注：与胃癌组比较，*P<0.05

表2 联合检测阳性率与单项阳性率的比较 例

表3 CEAmRNA与CK20mRNA的表达与肿瘤临床因素的关系 例(%)

3 讨论

目前研究认为胃癌患者术后转移和复发是胃癌治疗失败的主要原因。郑树等[2]的研究认为临床转移一般都是由微转移发展而来。血行转移是胃癌患者转移的主要途径之一，及早发现患者血液中是否有微转移可筛选出有转移倾向的高危患者，对指导诊断治疗和判断预后具有一定的意义。一般当发生微转移时，患者常无临床症状，常规的彩超，CT，MRI，病理检查很难发现。目前认为对外周血中肿瘤标志物的检测是确诊微转移的主要方法[3]，但是外周血中这些标志物水平较低，常规的检测方法检测不到，容易漏诊，而RT-PCR可以通过对目的基因扩增从而检测出含量很少的检测物，因此RT-PCR是目前用于检测肿瘤微转移的常用分子生物学方法[4]。

CK20是细胞角蛋白的一种组分，具有上皮特异性分布，在正常的血液及骨髓中均不表达，它主要分布在胃肠黏膜上皮细胞、尿路黏膜表层细胞和表皮的Merkel细胞，并且特异性地存在于这些细胞来源的肿瘤内[5]。有研究认为CK20与结肠癌、移行细胞癌的分化、分期有关[6]。CEA在胚胎中大量存在，在正常成人血中存在微量；CEAmRNA存在于细胞内，几乎仅在肿瘤细胞中出现持续表达。现在临床上大都检测血浆中的CEA蛋白，有时细胞内CEA大量增殖，却不分泌CEA蛋白到细胞外，因此细胞内CEAmRNA的检测意义更大[7]。本研究结果显示胃癌患者中55.4%的CK20mRNA的阳性，而良性组中未检测到CK20mRNA的表达。盛虹等[8]的研究有48.1%的胃癌患者外周血中检测到CK20mRNA的表达，正常对照组及良性病变组中未检测CK20mRNA的表达，表明CK20mRNA在多数胃癌患者中存在。本研究中胃癌患者外周血中CEAmRNA的阳性表达率分别是62.5%，而良性组中无表达，与杨万勇等[9]的研究结果相符。可见胃癌患者外周血CEAmRNA与CK20mRNA的阳性表达可以认为外周血中有肿瘤细存在，可以作为癌细胞血液转移的重要标志之一。联合检测阳性率(两项至少有一项阳性)为76.8%，较单项阳性率(CEAmRNA为62.5%，CK20mRNA为55.4%)为高，虽然差异无统计学意义，但提示联合检测有助于提高检出率。同时，本资料还证实CEAmRNA的阳性表达与肿瘤患者的性别、年龄和肿瘤位置无明显关系，而与分化程度，组织类型，临床分期，淋巴结转移明显相关，差异有统计学意义；CK20mRNA的阳性表达与肿瘤患者的性别、年龄和肿瘤位置，分化程度无明显关系，而与组织类型，临床分期，淋巴结转移明显相关，差异有统计学意义，与大多数研究结果[10，11]一致。以上结果可能由于肿瘤分期越晚，淋巴结转移越多，阳性率就越高，即随着肿瘤的逐渐增大，释放入血循环中的癌细胞也越多，复发或转移的几率就越大，预后就愈差。并且发现随着临床分期的增加，这些肿瘤标志物的表达率也明显升高，有淋巴结转移的患者较未转移的患者阳性率也明显升高。有研究表明CEAmRNA与CK20mRNA的表达与肿瘤的病期和预后密切相关[11]。

总之，通过RT-PCR检测胃癌患者血液中CEAmRNA与CK20mRNA的表达，可以监测肿瘤细胞的血行转移，是一种较好的诊断胃癌转移复发的方法。微转移的检测较常规检查具有更高的敏感性，是一个重要的指标，对胃癌患者分期、判断预后、确定手术方式和术后的综合治疗方案具有重要的指导作用。

1 Raj GV， Moreno JG， Gomella LG. Utilization of polymerase chain reaction technology in the detection of solid tumors. Cancer，1998，82：1419-1442.

2 郑树，董琦，陈益定，等.与胃肠道恶性肿瘤转移和预后相关的肿瘤细胞分子生物学特征.中华胃肠外科杂志，2004，7：429-431.

3 Demirbas S， Sücüllü I， Yildirim S，et al.Influence of the c-erbB-2，nm23，bcl-2 and p53 protein markers on colorectal cancer.Turk J Gastroenterol，2006，17：13-19.

4 Ikeguchi M， Ohro S， Maeda Y， et al. Detection of cancer cells in the peripheral blood of gastric cancer patients.Int J Mol Med，2003，11：217-221.

5 Busam KJ， Jungbluth AA， Rekthman N， et al.Merkel cell polyomavirus expression in merkel cell carcinomas and its absence in combined tumors and pulmonary neuroendocrine carcinomas. Am J Surg Pathol，2009，33：1378-1385.

6 Bressenot A， Zimmer O. CK20/CK7 protein expression in colorectal cancer：a marker for progression of colorectal cancer.Hum Pathol，2008，39：1714.

7 娄柏松.定量RT-PCR法检测CK20mRNA、CEAmRNA在胃肠道肿瘤外周血中的表达.齐齐哈尔医学院学报，2008，29：1032-1034.

8 盛虹，吴方，魏旭倩，等.恶性肿瘤外周血微转移检测的临床研究. 中国实验诊断学，2008，12：1010-1013.

9 杨万勇，杜宗孝，蔡永梅，等.胃癌患者外周血癌细胞CEAmRNA表达与胃癌微转移关系的研究.宁夏医学杂志，2001，23：262-264.

10 费建东，聂双发，胡晓峰，等.胃癌患者外周血微转移指标的检测及意义. 中国老年学杂志，2011，31：4319-4321.

11 黄卫国，赵 强，曾庆彪，等.角蛋白19/20表达与胃癌组织学类型及转移的关系. 南华大学学报·医学版，2010，38：341-344.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.02.015

061100 河北省黄骅市人民医院外一科(王玉文、任意)；河北北方学院附属第一医院普外科(费建东、聂双发)

R 735.2

A

1002-7386(2014)02-0200-03

2013-07-15)