过表达KLF4对棕榈酸所致L6骨骼肌细胞胰岛素抵抗的影响

张哲 王超

·论著·

过表达KLF4对棕榈酸所致L6骨骼肌细胞胰岛素抵抗的影响

张哲 王超

目的 探讨Krüppel样因子4 (KLF4)过表达对大鼠L6骨骼肌细胞胰岛素抵抗的影响。方法采用棕榈酸诱导法建立大鼠L6骨骼肌细胞的胰岛素抵抗模型，随机分为对照组和转染组。对照组转染腺病毒空载体(Ad)，转染组转染KLF4腺病毒表达载体(Ad-KLF4)。采用Real-time PCR和Western-blot检测两组KLF4、胰岛素受体(IR)和葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的表达水平，采用葡萄糖氧化酶法检测两组培养液中的葡萄糖浓度。结果与对照组比较，棕榈酸诱导组对葡萄糖的摄取量显著降低(P<0.05)，KLF4、IR、GLUT4表达显著下调(P<0.05)。KLF4过表达可显著提高细胞对胰岛素的敏感性，并上调IR、GLUT4表达。结论过表达KLF4可导致IR、GLUT4表达上调，并改善骨骼肌细胞的胰岛素抵抗。

Krüppel样因子4;基因转染;骨骼肌细胞;胰岛素抵抗

胰岛素抵抗是机体靶组织(骨骼肌、肝脏、脂肪)对胰岛素敏感性降低的一种病理状态，长期胰岛素抵抗与糖尿病、肥胖及高血压等心血管疾病的发病密切相关，而骨骼肌是胰岛素刺激下机体摄取并利用葡萄糖的主要靶器官[1]。Krüppel样因子4 (Krüppel-like factor 4，KLF4)是一种锌指蛋白转录因子，在细胞增殖、分化、血管形成、肿瘤发生发展中发挥广泛的调控作用[2]。Aktug等[3]采用免疫组织化学方法证实，KLF4在STZ诱导的Ⅰ型糖尿病大鼠睾丸组织表达下调，提示KLF4与糖尿病的病理过程有关。然而，KLF4在骨骼肌胰岛素抵抗中的作用目前尚未见报道。本实验采用L6骨骼肌细胞株，通过棕榈酸诱导造成胰岛素抵抗模型，旨在观察KLF4过表达对胰岛素抵抗的影响，为研究胰岛素抵抗的分子机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 L6细胞株(中国协和医科大学细胞中心)；α-MEM、胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA)、胰蛋白酶(美国GIBCO公司)；葡萄糖氧化酶试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)；多克隆抗体(美国Sigma公司)。Lipofectamin 2000、RT-PCR相关试剂(美国Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、胰岛素抵抗模型的建立和鉴定5% CO2、37℃饱和湿度条件下,将复苏后的大鼠L6肌细胞接种在含10%FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的α-MEM培养基中培养。2 d后更换含2% FBS的α-MEM培养基进行诱导培养，每天换液1次，直至细胞长出肌管。细胞消化后转入24孔板(1×106个/孔)，随机分为对照组和诱导组。对照组加入正常α-MEM培养基，诱导组加入含0.3 mmol/L棕榈酸的α-MEM培养基，培养24 h。两组细胞用预冷PBS洗涤2次，先加入含100 ng/ml胰岛素的正常培养基孵育30 min，再加入5.6 mmol/L葡萄糖孵育24 h。采用葡萄糖氧化酶法测定细胞上清液中葡萄糖浓度。

1.2.2 重组腺病毒转染将大鼠全长KLF4 cDNA序列克隆到腺病毒表达载体pAd/CMV/V5-DEST中。酶切和测序鉴定后，将空载体病毒及重组腺病毒利用Lipofectamin 2000脂质体转染A293细胞，包装、扩增后得到重组腺病毒质粒Ad-KLF4。转染24 h后反复冻融裂解细胞收集上清液，G418筛选阳性克隆并培养14 d。诱导组细胞随机分为空载体对照组(Ad)和转染组(Ad-KLF4)，继续培养48 h用于病毒感染。

1.2.3 Real-time PCR：根据GeneBank中大鼠KLF4、IR、GLUT4 mRNA序列，采用DNAMAN软件设计引物，引物序列见表1，由上海生物工程技术服务有限公司合成。Trizol提取各组细胞总RNA,用紫外分光光度计鉴定RNA的纯度并定量。参考逆转录试剂盒说明书操作合成cDNA第1链。PCR 反应采用ABI 7300型荧光定量PCR仪。目的基因相对表达量RQ =2-△△Ct，设GAPDH为内参照基因。

表1 KLF4、IR、GLUT4、GAPDH引物序列及扩增产物长度

1.2.4 Western-blot各组细胞培养48 h后提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。蛋白样品按4∶1体积比加入5×上样缓冲液内混匀，100℃煮沸5 min变性。将100 μg总蛋白进行10% SDS-PAGE，电转移至PVDF膜上，10%脱脂奶粉封闭2 h。用特异性一抗(1∶2 000) 4℃孵育过夜，TBST洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(1∶5 000)室温孵育1 h,洗膜后ECL化学发光法显色、定影。用UVP软件分析，检测蛋白条带IOD值。

2 结果

2.1 对照组和诱导组葡萄糖代谢水平的比较 葡萄糖消耗实验结果显示，诱导组细胞上清液中葡萄糖浓度(13.09±2.52)mmol/L与对照组(3.74±0.12)mmol/L比较显著增加(P<0.05)，提示棕榈酸诱导L6肌细胞IR模型建立成功。

2.2 对照组和诱导组KLF4、IR、GLUT4表达的比较 以GAPDH为内参照，Real-time PCR和Western-blot结果显示，诱导组KLF4/GAPDH、IR/GAPDH、GLUT4/GAPDH mRNA相对表达水平与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2，图1。

组别KLF4/GAPDHmRNA相对表达水平IR/GAPDHmRNA相对表达水平GLUT4/GAPDHmRNA相对表达水平对照组0．81±0．330．88±0．360．75±0．28诱导组0．32±0．08∗0．47±0．16∗0．42±0．11∗

注：与对照组比较，*P<0.05

图1 棕榈酸刺激对KLF4、IR、GLU4蛋白表达的影响

2.3 Ad-KLF4转染L6肌细胞对IR、GLUT4表达和葡萄糖代谢的影响 结果显示，转染L6肌细胞48 h后， Ad-KLF4组 KLF4/GAPDH mRNA、IR/GAPDH mRNA和GLUT4/GAPDH相对表达水平与Ad组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。细胞对葡萄糖的代谢能力亦明显改善，Ad-KLF4组细胞上清液中葡萄糖浓度(7.6±1.3)mmol/L与空载体对照组(13.2±2.7)mmol/L比较显著降低(P<0.05)。见表3，图2。

组别KLF4/GAPDHmRNA相对表达水平IR/GAPDHmRNA相对表达水平GLUT4/GAPDHmRNA相对表达水平Ad组0．30±0．060．43±0．130．39±0．08Ad⁃KLF4组0．72±0．31∗0．65±0．24∗0．62±0．18∗

注：与Ad组比较，*P<0.05

3 讨论

胰岛素抵抗是周围组织对胰岛素敏感性降低，胰岛素刺激下葡萄糖的利用率下降，导致糖脂代谢紊乱的一种病理状态。胰岛素抵抗形成机制的研究对糖尿病的预防和治疗具有重要意义。而体内葡萄糖主要被骨骼肌组织摄取和利用，骨骼肌对葡萄糖的转运障碍是Ⅱ型糖尿病胰岛素抵抗的重要原因。

图2 过表达KLF4对IR、GLUT4蛋白表达和葡萄糖代谢水平的影响

KLF4是一种具有结合位点特异性的锌指结构转录因子，其羧基端含有3个连续且高度保守的锌指结构(CX2-4CX3FX5LX2HX3H)，此为该家族的典型结构特征。KLF4通过与p53、细胞周期蛋白D1等下游基因启动子区的结合元件结合调控目的基因的转录，在细胞增殖、分化和凋亡过程中发挥广泛的调控作用。迄今研究发现，KLF4与肿瘤发生、皮肤屏障形成、睾丸发育等生理、病理过程密切相关[4]。

2013年，Aktug等[3]研究提出在Ⅰ型糖尿病大鼠睾丸组织石蜡切片中KLF4表达水平明显降低，提示KLF4参与了糖尿病的病理过程。然而，KLF4对骨骼肌胰岛素抵抗的影响目前尚未见报道。为了阐明KLF4在骨骼肌胰岛素抵抗中的作用，我们建立了L6骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型。Real-time PCR和Western-blot方法证实，诱导组细胞KLF4、IR、GLUT4表达显著下调，且细胞对葡萄糖的摄取量显著降低。进而，

我们利用腺病毒表达载体将外源KLF4基因成功导入L6细胞，使之在细胞中高效表达。我们发现过表达KLF4可明显上调IR、GLUT4的表达并改善骨骼肌细胞的胰岛素抵抗，提示 KLF4参与了骨骼肌胰岛素抵抗的发生发展。

目前，KLF4在细胞内的信号调节机制尚未完全阐明。多项研究表明，KLF4和p300相互作用造成KLF4乙酰化后通过增强肠碱性磷酸酶、p21、Mfn2启动子活性促进这些基因的转录和表达[5,6]。在骨骼肌细胞，KLF4是否通过上述机制调控胰岛素抵抗过程还有待于进一步研究。总之，本研究首次提出KLF4对骨骼肌胰岛素抵抗产生负性调控作用，KLF4可能通过上调IR、GLUT4的表达减轻骨骼肌胰岛素抵抗。研究KLF4在骨骼肌胰岛素抵抗中的作用有助于阐明疾病发生的分子机制，从而对疾病的防治提供潜在的治疗靶点。

1 Lipina C,Macrae K,Suhm T,et al.Mitochondrial substrate availability and its role in lipid-induced insulin resistance and proinflammatorysignalingin skeletal muscle.Diabetes,2013，62：3426-3436.

2 Lin ZS,Chu HC,Yen YC,et al.Krüppel-like factor 4,a tumor suppressor in hepatocellular carcinoma cells reverts epithelial mesenchymal transition by suppressing slug expression.PLoS One,2012,7：43593.

3 Aktug H,Uysal A,Yavasoglu A,et al.The detrimental effects ofdiabeteson pluripotency determined byKLF4,SOX2,C-MYC and OCT4 immunoreactivity in rat testes.Adv Clin Exp Med,2013,22:327-335.

4 Evans PM,Liu C.Roles of Krüpel-like factor 4 in normal homeostasis,cancer and stem cells.ActaBiochimBiophys Sin,2008,40:554-564.

5 Rui ZH,Mei HA,Bin ZH,et al.Krüppel-like factor 4 interacts with p300 to activate mitofusin 2 gene expression induced by all-transretinoic acid in VSMCs.ActaPharmacologica Sinica,2010,31:1293-1302.

6 Evans PM,Zhang W,Chen X,et al.Krüppel-like factor 4 is acetylated by p300 and regulates gene transcription via modulation of histone acetylation.J Biol Chem,2007,282:33994-34002.

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本刊编辑部

EffectofKLF4overexpressiononpalmitate-inducedinsulinresistanceinL6skeletonmusclecellsofrats

ZHANGZhe,WANGChao.KeyLaboratoryaboutGeriatricMedicine,HebeiProvincialPeople’sHospital,Shijiazhuang050051,China

ObjectiveTo investigate the effect of Krüppel-like factor 4 (KLF4) overexpression on palmitate-induced insulin resistance in L6 skeleton muscle cells of rats.MethodsThe insulin resistance models in L6 skeleton muscle cells of rats were induced by palmitic acid,which were randomly divided into two groups,control group and experiment group.The differentiated L6 skeleton muscle cells in control group were transfected with adenovirus empty vector (Ad),however,which in experiment group were transfected with KLF4 adenovirus expression vector (Ad-KLF4).The expression levels of KLF4,insulin receptor (IR) and glucose transporter type 4 (GLUT4) in both groups were detected by Real-time PCR and Western Blot.ResultsAs compared to those in control group,the expression levels of KLF4,IR and GLUT4 in experiment group were significantly down-regulated (P<0.05),and the intaking amount for glucose was obviously decreased (P<0.05).The overexpression of KLF4 could enhance the sensitivities of the cells to insulin,and could up-regulate the expression levels of IR and GLUT4.ConclusionKLF4 overexpression can up-regulate the expression levels of IR and GLUT4,and can improve insulin sensitivities of L6 cells effectively.

Krüppel-like factor 4;gene transfection;skeletal muscle cell;insulin resistance

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.02.001

项目来源：河北省自然科学基金(编号：C2011307008)

050051 河北省石家庄市，河北省人民医院省老年医学重点实验室

王超，050051 河北省石家庄市，河北省人民医院省老年医学重点实验室；

E-mail：13731156811@163.com

R 347.8

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1002-7386(2014)02-0165-03

203-08-07)