黄芪药材有效成分含量的相关性研究

★ 菅晓勇 邓双炳

(1.北京康乐卫士生物技术股份有限公司 北京 100176；2.北京博爱汇康医药科技有限责任公司 北京 100176)

黄芪药材[Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge]为常用补中益气类中药，在抗肿瘤、抗疲劳、增强免疫等方面具有广泛的药理活性，而这些诸多药理活性的体现源于中草药内在的多种活性成分综合相互作用的结果。黄芪素以“炮台芪”的质优、纯正享誉海内外，且与药材具体的基源、产地和生长年限有着千丝万缕的密切联系，其中尤以体现在主要的有效化学成分皂苷类、黄酮类以及多糖类的含量方面[1-4]。然而《中国药典》(2010版)中仅规定黄芪甲苷和毛蕊异黄酮苷含量作为黄芪质量的主要评价指标，显然不能全面地反映药材的内在质量，需要探索更为科学的评价指标和体系，近几年的研究前景显示多指标综合评价体系用于黄芪质量评价可能具有更好的应用前景[4-6]。

为此，本文对黄芪药材含有的5种主要有效(活性)化学成分的总量和基于《中国药典》(2010版)的3种相关单一成分分别进行含量测定并归纳分析，对分析测定结果进行多指标、多元分析，研究黄芪药材内在有效成分含量之间的相关性，以期为黄芪质量评价和内在质量控制方法的科学性、合理性以及简便化，尤以探索黄芪药材质控方法的“一测多评”提供可能的研究基础。

1 实验材料

1.1 药材 本文研究所用的黄芪样品均为原产地实地采集或购于当地(No.1-No.10)，全部样品均经中国医学科学院药用植物研究所郭宝林老师鉴定基源为蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch) Bge var.mongholicus(Bge)Hsiao(除No.1)。上述药材待自然干燥后截成小段，60°C烘箱中干燥6～8h，粉碎过筛后，作为含量测定用样品，见表1。

1.2 对照品及试剂 葡聚糖、芦丁、毛蕊异黄酮、芒柄花素、黄芪甲苷对照品均购买于中国食品药品检定研究院(含量测定用)；化学试剂：乙腈和甲醇均为色谱纯级，其他试剂为分析纯级。

1.3 仪器 安捷伦1260型液相色谱仪(美国安捷伦科技公司)；Chromachem-6100型ELSD检测器(美国ESA公司)；UV5100型紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)；BSA224S-CW型电子分析天平(德国赛多利斯公司)，HH-4型数字化显示恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)；320-S型酸度计(瑞士梅特勒-托利多公司)。

表1 不同产地来源、生长年限的10批黄芪药材样品

注：上述10批次黄芪药材样品均为当地随机上山采集或当地采集后随机购买。

图1 黄芪药材黄芪甲苷HPLC图谱(c峰为黄芪甲苷峰)

2 测定方法与含量结果

2.1 黄芪甲苷的含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱为Hypersil ODS2(4.6mm×250mm，5μm)；ELSD参数：雾化温度：35°C，蒸发温度：50°C，氮气压力：1.5 bar；流动相为乙腈∶水(32∶68)，流速1.0 mL/min，进样量20μL；分离度、理论板数等应符合药典要求。

2.1.2 配制对照品溶液 黄芪甲苷对照品精密称定5mg，加甲醇溶解并定容至10mL容量瓶中，配制成0.5 mg/L的溶液，4°C冰箱保存，备用。

2.1.3 测定方法 参照《中国药典》(2010年版Ⅰ部)黄芪项下规定的样品处理及测定方法进行黄芪甲苷含量的测定(见图1)，以外标两点法计算黄芪甲苷的含量，结果见表2。

2.2 黄芪多糖的含量测定

2.2.1 制备蒽酮-浓硫酸溶液(0.2%)及葡聚糖对照品溶液 精密称定蒽酮适量，缓慢加入至已置于避光棕色瓶中的浓硫酸溶液中，配制成0.2%的蒽酮-浓硫酸溶液，4°C冰箱保存，备用。

购买的葡聚糖对照品首先经105°C干燥至恒重，精密称定3mg，置于10mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，即得每1 mL含0.3mg的对照品溶液。

2.2.2 样品测定[3,7]精密称取黄芪细粉样品5.0g，加水100mL置250mL烧瓶中，沸水浴提取3次，第一次提取时间为1h、第二次和第三次各提取0.5h，三次合并后的滤液浓缩至约10mL，配成含80%乙醇的混合溶液，4°C冰箱中静置24 h，70%乙醇三次洗涤滤渣，60°C干燥，即得粗多糖并精密称重。

取适量的黄芪粗多糖样品，加温水溶解制备成0.13 mg/mL粗多糖供试品溶液，量取0.4 mL，加水稀释5倍后缓慢加入4.0 mL的蒽酮-浓硫酸溶液(0.2%)，不断震荡中进行10min沸水浴，反应液用冰水冷却至室温，稳定显色0.5h后采用紫外分光光度计于625 nm处(葡聚糖最大吸收波长)测定吸收度，以葡聚糖对照品溶液外标两点法进行计算，测定黄芪多糖含量，结果见表2。

2.3 黄芪总皂苷的含量测定

2.3.1 配制黄芪甲苷对照品溶液 黄芪甲苷对照品精密称定4mg，加甲醇溶解并定容至10mL容量瓶中，配制成0.4 mg/L的溶液，4°C冰箱保存，备用。

2.3.2 样品测定[3,8]精密称取40目过筛后的黄芪粉末2.0g，加100mL甲醇在250mL圆底烧瓶中冷浸过夜，第二天冷浸液甲醇回流提取2 h，甲醇25mL洗涤滤渣3次，浓缩滤液，50mL水饱和的正丁醇残渣将残渣溶解转移至100mL分液漏斗中，加氨试剂各洗涤3次，第一次洗涤液为30mL、第二次和第三次各为20mL，20mL水饱和的正丁醇洗涤合并后的氨试剂层，正丁醇层收集液60°C水浴蒸干，残渣用100mL甲醇溶解作为供试品溶液。

精密量取供试品溶液0.4mL，加入0.2mL香草醛-冰醋酸溶液(5%)和0.8mL高氯酸溶液，混合均匀，置70°C水浴中15min，冷却。精密加入5mL冰醋酸，摇匀后在581nm处(黄芪甲苷最大吸收波长)测定吸光度，以黄芪甲苷对照品溶液外标两点法进行计算，测得黄芪总皂苷含量(见表2)。

2.4 黄芪总黄酮的含量测定

2.4.1 对照品溶液的配制 精密称芦丁对照品5mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得每1 mL含0.5mg的芦丁对照品溶液，备用。

2.4.2 样品测定[9,10]精密称取黄芪样品2.0g(过筛40目、60°C干燥5 h)，置100mL容量瓶中，加甲醇35mL，超声分别提取三次(时间分为30，30，5min)，滤液加甲醇定容至50mL容量瓶中，作为供试品溶液。

精密量取2.0mL供试品溶液，加水1.0mL，置小反应瓶中，加入5% NaNO20.4 mL混合均匀，6min后加入0.4mL 10% Al(NO3)3摇匀，6min后再加4% NaOH 4 mL，后用蒸馏水定容至10mL容量瓶中，摇匀，采用紫外分光光度计于500 nm处(芦丁最大吸收波长)测定吸收度，以芦丁对照品溶液的外标两点法进行计算上述黄芪样品中有效成分总黄酮的含量(结果见表2)。

2.5 黄芪样品中水分、干物质(DM)及粗脂肪(TP)含量测定 参照《中国药典》2010版具体项下要求进行黄芪样品的水分和干物质(DM)含量测定。备注：黄芪样品扣除水分后的药材干重占样品全部重量的比重定义为黄芪干物质含量。结果详见表2。

黄芪粗脂肪的测定方法如下：精密称定黄芪粉末4.0g，置烘箱中105°C干燥。取样品适量，精密称定后用锡箔滤纸包裹，采用70mL石油醚(60°C～90°C)在抽提瓶中提取4 h，提取液减压回收石油醚，残渣干燥至恒重，称重计算黄芪样品中所含有效成分粗脂肪的含量，具体结果见表2。

2.6 黄芪中毛蕊异黄酮和芒柄花素含量测定

2.6.1 色谱条件 色谱柱为Hypersil ODS2 (4.6mm×200mm，5μm)；梯度洗脱条件-流动相：乙腈(A)：水(0～25min,17%～31%(A)；26min，35%(A)；26～45min，35%(A)；45～60min，35%～17%(A)；进样量20μL，流速1.0mL/min。

2.6.2 芒柄花素和毛蕊异黄酮对照品溶液的制备 分别称取芒柄花素及毛蕊异黄酮对照品适量，精密成定后加甲醇制备成相应溶度的对照品溶液，4°C冰箱保存，备用。

2.6.3 样品测定[10-12]精密称取黄芪样品0.5g(过筛40目、60°C干燥5 h)，置100mL圆底烧瓶中，加80%甲醇30mL，3次回流提取，每次提取时间均为1h，滤液合并后回收甲醇试剂，所得残渣甲醇溶解、定容，作为供试品溶液。按2.6.1项下色谱条件进样测定芒柄花素和毛蕊异黄酮成分的含量(详见色谱图2)，结果见表2。

表2 黄芪药材(10批)中有效成分的含量测定结果

注：IS1(X1)：毛蕊异黄酮；IS2(X2)：芒柄花素；TIS(X3)：总黄酮；AS1(X4)：黄芪甲苷；TAS(X5)：总皂苷；CF(X6)：粗脂肪；TP(X7)：总多糖；DM(X8)：干物质。

1.毛蕊异黄酮；2.为芒柄花素

3 结果与分析

3.1 黄芪药材有效化学成分含量结果分析

由表2可知，10批黄芪药材中有效(活性)成分芒柄花素、粗脂肪、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮以及总多糖含量存在较大的差异。黄芪药材NO.1～NO.10中芒柄花素含量为33.98～238(77.9±62.9)μg/g，粗脂肪含量为9.9～5.1(15.1±4.9)mg/g，黄芪甲苷含量为539～2156(1500±650)μg/g，毛蕊异黄酮含量为109.2～791.6(437.5±243.5)μg/g，总多糖含量为0.78～10.28(5.67±3.14)%等。由上述10批次黄芪样品8种有效成分的含量测定结果分析，我们发现上述所有样品中山西浑源下韩乡野生黄芪药材整体上含有较高芒柄花素、粗脂肪、黄芪甲苷、总多糖以及干物质等有效成分；陕西野生黄芪样品的总黄酮含量则相对较高，广灵栽培黄芪样品整体总皂苷和毛蕊异黄酮两种成分含量较高，而浑源县下韩乡栽培黄芪具有含量较高的总多糖成分，相反整体而言四川以及黑龙江(膜荚)两地黄芪药材中的上述8种成分均具有较低的含量。

综上所述，山西为黄芪的道地产区，适宜的海拔、水文气候和土壤中丰富的矿物元素使浑源县下韩乡黄芪样品(野生和人工栽培)整体上具有较高含量的有效成分；四川和黑龙江地区可能不太适宜黄芪中有效成分的积累，以致各有效成分含量整体水平较低。

3.2 10批次不同产地黄芪药材的质量评估与内在8种有效成分之间相关性分析

3.2.1 黄芪药材中有效成分之间PCA相关性分析 采用主成分分析(PCA)方法对上述10个批次黄芪(不同产地来源和年限)，可能影响黄芪药材内在质量的总成分和单一成分共8种主要有效成分进行主成分分析，以各成分的特征值和贡献率(方差百分比)及累计贡献率进行综合评估。结果表明，第一主成分的特征贡献率为39.7%，主要有效成分为黄芪甲苷(X4)、总多糖(X7)、粗脂肪(X6)、干物质(X8)；第二主成分的总黄酮(X3)、总皂苷(X5)、毛蕊异黄酮(X1)为主要有效化学成分，整体特征贡献率为28.1%；第三主成分的主要有效成分为总多糖(X7)，整体特征贡献率为12.6%。

3.2.1.2 10个批次不同产地和年限黄芪样品的聚类分析

图3 10批黄芪药材聚类Score图

鉴于第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的累积贡献率为67.8%(3.2.1项下计算)，采用PCA分析软件(SIMCA-P 11.5版本)在第一主成分和第二主成分综合效益分析基础上对上述不同产地来源和年限的10批次黄芪样品进行生物生态学的聚类分析，结果详见图3。结果显示，10批黄芪样品(No.1～No.10)共聚类分为三个分布组别，即聚类组别A～C(group A，B，C)。group A主要由山西浑源县下韩乡地区的6个野生与栽培黄芪样品组成，group B则有2个山西广灵栽培黄芪和陕西野生组成；相反，两个地域边缘化的四川理县黄芪和黑龙江(膜荚)样品组成group C。

3.2.2 黄芪药材中有效(活性)成分之间的关联性分析 本文采用SPSS11.5软件来分析黄芪有效化学成分含量之间的相互关联性，具体分析结果如下：①黄芪药材中有效化学成分毛蕊异黄酮含量(X1)与另一种有效成分总黄酮含量(X3)具有非常显著的正向相关性，拟合的相关方程和相关系数为X1=-1034+720.5X3(r=0.816，P=0.003)；②黄芪药材中有效化学成分芒柄花素含量(X2)与另一种有效成分粗脂肪含量(X6)同样具有显著正向相关性，拟合的相关方程及相关系数为X2=192.8-1.68(X6)2+0.0678(X6)3(r=0.961,P=0.0475)；③黄芪药材中法定的有效成分黄芪甲苷含量(X4)则与另一种有效化学成分总多糖含量(X7)具有非常显著正向相关性，拟合的相关方程及相关系数为X4=473+181X7(r=0.878，P=0.001)。

综上所述，我们可以采用黄芪药材内在的有效成分黄芪甲苷、毛蕊异黄酮以及芒柄花素的含量多少，一定程度上可以间接、客观地分别反映出黄芪样品中总多糖、总黄酮和粗脂肪的含量高低，不仅可以简化了黄芪样品质量测定的项目，同时有望发展成为一种新的思路用于黄芪药材质控，当然该思路和方法还需要更为广泛的样品量和实践中加以系数修订和完善。

4 结论与讨论

4.1 黄芪药材有效(活性)成分的主成分分析 本文对可能影响10批不同产地来源和生长年限的黄芪药材内在质量的8个主要有效成分指标进行了PCA主成分聚类和贡献分析。试验结果显示，黄芪样品中4种有效化学成分黄芪甲苷、总多糖、粗脂肪、干物质具有较大的贡献，为可能影响黄芪内在质量评估的主要指标，其次指标为总皂苷、毛蕊异黄酮、总黄酮，次之则为芒柄花素成分指标。

4.2 黄芪药材样品间及各指标成分聚类分析 综合图3以及主成分PC1特征贡献率为39.7%，是分析的主要方面，结合聚类分析结果，可以明显地用于区分山西浑源样品和其他产地黄芪样品，结合上述8种有效化学成分含量测定结果，本文大致可以得出以下结论：道地产区山西浑源县下韩乡野生黄芪内在整体有效化学成分含量最高，质量最好；道地产区山西浑源县下韩乡人工栽培黄芪样品的整体有效成分含量次之，质量相对较好；距离道地产区区域较近的山西广灵人工栽培黄芪样品与陕西野生黄芪样品的有效成分整体也较道地产区浑源县样品低，质量相比较浑源样品差；相反，区域相对边缘化且不为道地产区的四川理县地区和黑龙江(膜荚)黄芪的有效成分整体含量最低，质量也最差。

4.3 黄芪样品质量评价的成分相关性探索 在对上述不同产地来源和年限的10批黄芪样品中8个主要有效成分之间含量相互关联性分析结果表明，黄芪甲苷与总多糖、毛蕊异黄酮与总黄酮、芒柄花素与粗脂肪成分之间分别存在显著的正向相关性。综上所述，本文通过上述研究结果，一定程度上可以支持在黄芪多指标评价和质量研究时可以简化某些具体的检测项目，可以尝试采用一种有效成分的含量高低间接、客观地反映出另一种有效成分的含量多少，试图探索出黄芪质控的新思路(“一测多评”)，进而全面反映出黄芪药材内在质量的同时最大程度的节约资源。但该项研究还任重而道远，需要业内同仁们的共同努力，以便最终完善和相互修订。

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