过敏性鼻炎-哮喘综合征大鼠模型的建立与评价*

★ 史锁芳 周奎龙

(1.南京中医药大学附属医院 江苏 南京 210029；2.南京中医药大学 江苏 南京 210029)

基于已发表文献中的造模方法均为单纯过敏性鼻炎模型或哮喘模型，本次实验结合国内外文献报道，选择国内常用的SD大鼠，在传统模型制作方法基础上进行适当改良摸索出一种新的大鼠过敏性鼻炎-哮喘综合征模型建立方法，现报告如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物 清洁级健康雄性SD大鼠20只，由南通大学实验动物中心提供(实验动物生产许可证号:SCXK(苏)2008-0010)。将大鼠按体重采用随机区组法分为2组，每组10只。分别为:(1)对照组(193.89±7.17)g；(2)模型组(193.25±14.44)g；具有可比性。

1.2 试剂与仪器 (1)试剂:卵白蛋白:由上海伯奥生物科技有限公司提供，生产批号(101008)。(2)主要仪器:莱卡切片机(德国Leica公司,型号:RM2128)；荧光显微镜(日本制造，OLYMPUS型号:BX51)；照相机(日本制造，型号：OLYMPUS C-35AD-2)；超声雾化器(德国百瑞公司)；自制透明带盖塑料盒(50cm×30cm×20cm)等。

1.3 造模方法 运用卵蛋白致敏和鼻部滴注攻击法造模:卵白蛋白腹腔注射14天后，用卵白蛋白连续鼻部滴注7天，建立模型[1-3]。初次致敏第7天开始用卵白蛋白滴鼻，1次/天，10μL/次。连续滴鼻7天。之后隔日给予卵白蛋白1g/L滴鼻，以维持对鼻黏膜的刺激。每隔7天观察一次鼻部滴蛋白液30分钟内搔鼻次数和喷嚏次数。采取记分法记录鼻分泌物量、喷嚏次数及鼻痒程度。方法如下:(1)鼻涕:流至前鼻孔1分;超过前鼻孔2分;涕流满面3分。(2)喷嚏:4个以内1分;5～10个2分;10个以上3分。(3)鼻痒:轻度抓鼻1分;频繁抓鼻2分;抓鼻不止3分。自鼻腔激发开始观察30分钟，采用叠加法记分，总分超过5分为动物造模成功。

从第15日开始,将模型组大鼠置于密闭器皿内(自制的50cm×30cm×20cm透明带盖塑料盒),给予2%OVA溶液进行雾化吸入；对照组以生理盐水代替。设定雾化流量为3 mL/min,每次持续雾化20min激发哮喘,观察大鼠反应,以出现抖毛、毛发竖立、抓鼻、咳嗽、打喷嚏、腹式呼吸、呼吸急促甚则出现口唇、双耳紫绀、伸颈、缩胸、点头运动、抽搐、跌倒、大小便失禁等。待出现症状后,随机从正常组和模型组各取2只作病理切片,模型组较正常组支气管黏膜及黏膜下层组织有大量的嗜酸性粒细胞浸润、支气管壁增厚、平滑肌增生、管腔狭窄、组织黏膜轻度充血水肿等典型的气道炎症及重建表现,视为造模成功。

1.4 一般状况观测 观察实验期间各组大鼠的呼吸频率、精神、饮食、活动、毛发、大小便等。

1.5 标本采集与观测

1.5.1 大鼠血样采集 常规方法采血后用于血浆各指标的检测。

1.5.2 鼻部标本采集 大鼠麻醉处死后，完整切取头部：部分直接取鼻部标本冻存；部分用中性甲醛固定，取鼻部标本石蜡包埋，行HE染色。

1.5.3 肺部标本采集 分离主支气管，打开胸腔，结扎左侧支气管，通过主支气管下管约1cm进行右肺肺泡灌洗，每次注入37%生理盐水0.6mL，缓慢注入后再缓慢回抽共3次，收集1.35～1.55mL液体为合格，4℃，1 500rpm离心10min，上清于-20℃保存以备相关因子检测。肺泡灌洗液的离心沉淀物待进行细胞计数实验。左肺留取部分肺组织10%中性福尔马林和石蜡包埋后进行HE染色病理学检测。

2 结果

2.1 一般情况 对照组大鼠反应灵敏,未见异常。模型组经抗原激发后张口喘息,腹部翕动,易激惹,躁动不安,抖毛,抓鼻,打喷嚏,甚则出现口唇及双耳紫绀,饮水量明显增多,精神萎靡,食量减少,反应迟钝,活动明显减少或俯卧不动,毛色发黄卷曲,枯槁无华。造模后，造模各组大鼠鼻炎症状累计积分平均达到5分以上，与正常对照组有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 造模前后大鼠鼻炎症状积分比较

注：与对照组比较P<0.05。

2.2 肺泡灌洗液 大鼠模型组白细胞总数和嗜酸性粒细胞的百分比明显增加，与对照组比较，﹡﹡P<0.01，有显著的统计学意义。

表2 造模前后大鼠肺泡灌洗液中细胞总数及EOS水平

注：EOS采用瑞氏染色法，与对照组比较，﹡﹡P<0.01。

2.3 组织病理形态学的变化(HE染色)

对照组鼻黏膜及支气管粘膜上皮完整,细、小支气管结构正常,未见炎症细胞浸润；模型组:支气管粘膜上皮破坏明显,上皮细胞有不同程度坏死且有脱落，粘膜下可见大量嗜酸性细胞浸润，肺泡内有少量分泌物及炎性细胞。

2.3.1 鼻黏膜组织(已切片,HE×40)

2.3.2 肺组织(已切片.HE×10)

3 讨论

支气管哮喘(简称哮喘)是最常见的呼吸道疾病之一，哮喘的发病率居高不下，据统计全球约有3亿哮喘患者，目前已成为全球公共健康问题[4]。哮喘往往是全身性过敏性疾病的下呼吸道的表现，哮喘患者多伴有过敏性鼻炎(allergic rhinitis AR)。目前，AR已影响到10%～25%的世界人口[5]，我国儿童AR的患病率为21.9%～38.5%，2009年中国《变应性鼻炎诊断和治疗指南》显示我国中心城市变应性鼻炎的平均患病率为11.1%[6]，其中1/3的变应性鼻炎患者会发展成哮喘。有研究认为，患有AR的患者发生哮喘的风险是未患有AR的患者的3～6倍，哮喘患者中AR的发生率为80%左右，大多数重症哮喘患者不能达到良好控制的原因也包括AR的处理不规范。因此，AR是哮喘的一个重要的独立危险因素，对于伴有过敏性鼻炎的哮喘的治疗是我们面临的一个临床难题。

3.1 鼻-肺反射假说[7]如果鼻部疾病引起的分泌物倒流则可刺激咽喉部，从而引起支气管平滑肌收缩和下呼吸道炎症；尤其是AR时导致炎症介质直接流向鼻后刺激咳嗽感受器，造成炎症持续状态；持续释放的炎症介质可导致支气管平滑肌的痉挛，使血管通透性增加，炎症细胞激活并募集于气道，从而使支气管炎症反应表现出级联放大的效应。

3.2 变应性鼻炎和哮喘 AR与哮喘的发病都与特应性有关，AR和哮喘无论在发病机制还是病理生理过程都是一致的[8]。变应性鼻炎是接触过敏原后，由IgE介导产生鼻黏膜炎症，从而表现出鼻部症状的一种疾患。变应性鼻炎和哮喘都是IgE介导的I型变态反应，两者的病理学改变都存在着嗜酸性粒细胞的浸润[9]，变应性鼻炎是发生哮喘的重要而独立的危险因素。当前“同一气道，同一疾病”的观点已经被普遍接受，此观点强调了变应性鼻炎和哮喘的密切关系，这一点在变应性鼻炎与哮喘的研究中已经充分证实，因而在哮喘的诊断和治疗过程中，必须兼顾变应性鼻炎的治疗。2009年WHO在日内瓦会议上形成并在Journal of Allergy and Clinical Immunology杂志发表的《重症哮喘共识》[10]中强调了变应性鼻炎是哮喘控制的重要影响因素。2010年中华医学会呼吸病学会《难治性哮喘诊断与处理专家共识》中同样指出：变应性鼻炎在难治性哮喘患者中非常常见[11]。在国外进行的一项大规模变应性鼻炎与哮喘治疗的研究中发现：联合管理变应性鼻炎与哮喘可显著降低医疗费用、改善患者症状并提高患者的生活质量。

3.3 合格的动物模型研制，是研究开发过敏性鼻炎-哮喘综合征新方法新制剂的基础和必要条件，检索文献，尚未发现过敏性鼻炎-哮喘综合征动物模型的建立方法，为此我们进行了初步尝试。研究表明，气道慢性炎症是哮喘的病理学基础，支气管高反应性(BHR)和肺嗜酸性粒细胞(EOS)炎症是哮喘的主要特征。嗜酸性粒细胞对于气道炎症和气管高反应性的发生和发展关系极为密切[12]。本实验测定过敏性鼻炎-哮喘综合征大鼠模型BALF中的细胞因子和嗜酸性粒细胞的结果及组织病理学的观测与临床相符，发病机理相似，可以初步认为此模型制作方法是成功的，有一定的推广价值。当然，我们应当看到，物种之间的差异性也使得动物模型的局限性不可避免，没有一个模型能完全具有人类哮喘的特征，提示我们今后要合理利用动物模型。

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