利用微卫星标记分析不同保种场的保种效果

任 康，张 权，肖 炜，云 鹏，宁中华，侯卓成*

(1.北京市畜牧总站，北京 100107；2.中国农业大学 动物科技学院，北京 100193)

北京油鸡和北京鸭是我国优良的地方品种。北京油鸡以肉味鲜美、蛋品优良等特点而著称；北京鸭则具有早期生长速度快、肉质优良、适应性强等优点。两品种在我国均有相应的保种场。目前的保种效果如何，以及同一品种的保种场间的差异等问题一直是保种工作中较为关注的重点。利用分子标记分析各保种场保种群体的遗传基础可以从本质上阐明这些问题。微卫星是目前普遍使用的分子遗传学标记。微卫星标记具有多态性高、共显性、易于鉴定、检测重复性好、在基因组中广泛分布等优点[1]，目前在遗传图谱的构建[2]、QTL定位[3]、分子遗传多样性研究[4]、家系鉴定等方面得到普遍应用。本研究以微卫星标记对不同保种场的保种效果进行分析，旨在评价同一品种在不同保种场中的保种现状和效果，从而为探讨更合理、更有效的保种方案提供研究手段和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究所用北京油鸡由两个不同北京油鸡保种场(北京油鸡Ⅰ，北京油鸡Ⅱ)提供，北京鸭由两个不同的北京鸭保种场(北京鸭Ⅰ，北京鸭Ⅱ)提供。北京鸭、北京油鸡保种场都采用家系留种的方法进行留种。北京鸭保种场Ⅰ的保种群体规模为500只左右，采用公母1∶5的交配比例，组建家系留种。北京鸭保种场Ⅱ的保种群体规模为360只左右，每个保种场也是采用1∶5的方法组建家系留种。两个北京油鸡的保种场规模的留种群体在1 200(北京油鸡Ⅰ)～1 500只(北京油鸡Ⅱ)左右。每个保种场的采样样本量均为60只，公母比例为1∶1，并尽量保持各个个体之间无血缘关系。于翅下静脉采血1 mL，置于含有0.1 mL抗凝剂的离心管中，混匀后置于-20 ℃低温保存。

1.2 微卫星引物、荧光标记多重PCR扩增及其检测

按照检测标准上的微卫星，选取的北京油鸡23个微卫星座位分别为MCW0081、ADL176、MCW150、ADL123、LEI0166、MCW4、MCW0183、ADL225、MCW120、MCW104、LEI0066、ADL185、MCW0085、ADL212、MCW67、ADL201、MCW264、MCW0014、MCW330、ADL136、MCW 294、MCW0295和MCW174。北京鸭23个微卫星座位分别为APH01、APL80、APL81、SM011、APH10、APL82、CM012、SM013、APH09、APH11、APL26、APL78、APL79、APL83、SM06、SM07、APH14、APL36、CM011、SM010、APH07、APL77和SM09。

1.3 多重PCR扩增

根据荧光标记引物的颜色、扩增产物分子量及退火温度，对引物选择组合，每组引物的数量为3～4对，对所有材料进行扩增。PCR 反应体系总体积为20 μL，其中DNA模板(20 ng/μL)1 μL，10×PCR mix 10 μL，引物(10 μmol/L)0.3 μL，ddH2O 8.4 μL。PCR扩增测序(以退火温度55 ℃为例)为95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，35个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存待用。

1.4 扩增产物纯化

毛细管电泳对DNA的纯度要求非常严格，应尽量去除残留的盐分、蛋白质、残留的去污剂及RNA。

1.5 扩增产物的检测

在96孔板的每个孔中分别加1 μL纯化的PCR产物，9 μL甲酰胺和0.18 μL内标，3 000 r/min离心1 min；然后95 ℃变性5 min，置冰上10 min，离心后用ABI 3700进行毛细管电泳。

1.6 数据分析

待电泳完毕，对样品的原始数据用Genescan 3.7和Genotyper 3.7两套软件共同完成分析任务。用基因扫描程序Genescan进行微卫星原始数据扫描与分析，统计96个泳道的空道数，并计算每板样品的通过率(成功率)，作为检验与校正仪器电泳效果的依据。一般应将无峰样品的比例控制在5 %以内。在峰图扫描过程中，将Genescan 3.7程序的两大参数Size Standard和Parameters分别设置为GS500-250.szs 与GS500 Analysis.gsp。然 后 用Genotyper 3.7软件对数据进一步分析，从而确定不同样品扩增片段的长度。对分析的全部样品而言，一些品种扩增产物的变异会超出设定的预计范围，需要对Genotyper程序得到的部分数据加以校正。

1.7 统计方法

应用PopGen32软件(verion1.6)[5]计算等位基因频率、杂合度(Heterozygosity，H)、F统计量、遗传距离，计算公式参考Nei (1987) Molecular Evolutionary Genetics，并根据Botstein等的公式[5]应用picale软件(verion 0.6)计算多态信息含量(PIC)。

2 结果

2.1 地方品种微卫星座位的等位基因数、平均杂合度与多态信息含量

测定的北京油鸡和北京鸭所有23个微卫星标记中，均表现出多态性，分别检测到210、196个等位基因。各标记的等位基因数目有一定差异：北京油鸡Ⅱ标记MCW0183的等位基因数最多：14个；北京油鸡Ⅰ标记ADL201与北京油鸡Ⅰ、Ⅱ标记MCW150的等位基因数最少，均为2个。北京油鸡Ⅰ、Ⅱ的23个微卫星座位的平均等位基因数分别为6.8和7.2，平均期望杂合度分别为0.729 7和0.683 0，平均多态信息含量分别为0.699和0.533。北京油鸡Ⅰ座位MCW0183的等位基因数、平均多态信息含量和期望杂合度最高，除座位MCW150、ADL201为中低度多态外，其余微卫星座位的PIC均为高度多态位点；北京油鸡Ⅱ座位MCW0183的等位基因数和平均多态信息含量最高，座位ADL136的期望杂合度最高，除座位ADL123、ADL185、MCW0085、ADL136、ADL201、MCW294和MCW174为中低度多态外，其余微卫星座位的PIC均为高度多态位点。北京鸭Ⅱ标记SM011的等位基因数最多：16个，北京鸭Ⅱ标记APL82为纯合状态。北京鸭Ⅰ、Ⅱ的23个微卫星座位的平均等位基因数分别为6.6和6.8，平均期望杂合度分别为0.540 6和0.551 3，平均多态信息含量分别为0.498和0.508。北京鸭Ⅰ座位APL80的等位基因数、平均多态信息含量和期望杂合度最高，11个微卫星座位的PIC为高度多态位点；北京鸭Ⅱ座位APL80的期望杂合度和平均多态信息含量最高，座位SM011的等位基因数最高，15个微卫星座位的PIC为高度多态位点。4个群体中，北京油鸡Ⅰ的平均期望杂合度和平均多态信息含量最高，北京油鸡Ⅱ 的等位基因数量最多；北京鸭Ⅰ的平均期望杂合度、平均多态信息含量和平均等位基因数量均为最低。

23个微卫星座位在北京油鸡与北京鸭各群体中的等位基因数、期望杂合度和多态信息含量见表1、表2。

表1 北京油鸡23个微卫星座位的等位基因数、多态信息含量和杂合度

表2 北京鸭23个微卫星座位的等位基因数、多态信息含量和杂合度

2.2 F-统计量

F-统计量是用来测量群体间遗传分化程度的指标，通过每个座位的固定指数Fis、Fit和Fst检验群体的分化程度。北京油鸡和北京鸭各23个微卫星座位的F-statistics分析结果见表3、表4。23个微卫星座位在北京油鸡2个群体内的固定系数(Fst)在0.449 1(ADL123)和0.009 0(MCW150)之间变动，平均值为0.170 6。整个群体的个体固定系数(Fis)为0.689 3(MCW294)～-0.228 0(MCW150)，均值为0.157 6。北京鸭23个微卫星座位在2个群体内的固定系数(Fst)在0.289 6(SM010)～0.000 0(APL82)之间变动，平均值为0.030 1。整个群体的个体固定系数(Fis)为1.000(APH11、APL83、APH14、SM010)～-0.178 8(APH09)，均值为0.263 3。对于北京油鸡和北京鸭两个群体而言，北京油鸡的群体遗传分化程度较高，遗传分化系数达到0.157 6。

表3 北京油鸡F-statistics 统计分析结果

表4 北京鸭F-statistics 统计分析结果

2.3 遗传距离的估计

遗传距离是度量群体间遗传变异的尺度。本研究根据北京油鸡和北京鸭各自的23个微卫星座位上的等位基因频率，通过PopGen32软件计算不同群体之间的遗传相似度和遗传距离，结果见表5、表6。北京油鸡群体间的遗传相似性和遗传距离分别为0.400 1和0.915 3；北京鸭群体间的遗传相似性和遗传距离为0.914 3和0.089 6。结果表明，北京油鸡和北京鸭两个品种的不同群体间存在遗传分化，北京油鸡不同群体间的分化程度较高。

表5 北京油鸡遗传相似系数和遗传距离

表6 北京鸭遗传相似度和遗传距离

3 讨 论

从本研究的结果可以看出，23个微卫星座位在研究北京油鸡和北京鸭时，呈现出不同的多态现象。通过分析遗传杂合度(H)和多态信息含量(PIC)，可以看出不同座位在不同群体中的遗传变异程度不同。北京油鸡的两个群体所有位点杂合度均值都超过0.6，PIC 值也均大于0.5。北京鸭两个群体所有位点杂合度均值超过0.5，PIC值也在0.5左右。根据Vanhala[6]确定的微卫星位点PIC大于0.5时，属于高度多态座位的标准，表明除了北京鸭Ⅰ外，其余3个群体均属于高度多态群体。本研究中的北京油鸡平均杂合度与多态信息含量均高于吴信生等[7]所报道；北京油鸡平均杂合度比高玉时等[8]报道的北京油鸡平均杂合度略高，但多态信息含量又略低于其报道；本研究中的北京鸭平均杂合度和多态信息含量略高于汤青萍等[9]报道，其原因可能是选取的微卫星标记以及微卫星座位数的多少不同所造成，这也反映保种场较好的保种效果，维持了中国地方鸡品种内具有较高杂合度的重要特点，也实现了尽量不使未来可能利用的遗传基因丢失的保种目的。

从研究结果中我们也能看到同一品种间的差异。在许多微卫星位点中，即使是同一品种，其等位基因数以及种类也有差异，如试验中的MCW174位点在北京油鸡Ⅰ中有9个等位基因，而在北京油鸡Ⅱ中则有6个等位基因，北京鸭标记APL82在北京鸭Ⅰ中有6个等位基因，而在北京鸭Ⅱ中则表现为纯合位点。同时，即使是等位基因一致，其基因频率、杂合度和PIC值也不尽相同，这表明同一品种在保种场之间也已经有了一定的差异和分化。产生差异和分化的原因可能与保种的原始群体、保种的方法、环境的影响以及实验中的误差有关。

通过Hardy-Weinberg平衡检验，4个群体的大多数微卫星座位处于平衡状态，反映了所抽取的样本和样本量基本能反映群体的实际情况，少数几个座位处于不平衡状态。这可能是样本或检测方法引起。在微卫星位点检测时，存在于检测样本中的微卫星位点的部分等位基因可能检测不到，从而造成“哑等位基因”[10～11]的出现，进而造成该位点的纯合子过多的现象。处于不平衡状态的位点，同时具有较大的Fis值，反映该位点杂合子远低于期望杂合子数目。北京油鸡23个位点的Fst均值约为17%，可以解释为群体间的差异。

从遗传距离来看，北京油鸡和北京鸭品种内保种场间的遗传相似系数分别为0.4和0.9，表明北京油鸡保种场间有了一定的遗传分化。根据他人实验结果[12～15]，可以看出两个品种的两个保种群均产生了分化，北京鸭两个保种场的遗传距离为0.089 6，而北京油鸡保种场的遗传距离则达到0.915 3。尽管北京油鸡的群体规模比较大，但是两个保种场之间的遗传距离显著大于两个北京鸭保种场之间的遗传距离。从分析结果来看，北京鸭在两个保种场之间采用合适的保种方法，从而能较好地保护北京鸭群体的多样性以及品种的基因。需要对两个北京油鸡保种场的保种、引种等做进一步调查，研究两个群体之间遗传距离增加的原因。适当增加保种群体的大小和场间的交流，在一定程度上可以减小差异的存在，进而达到更好的保种效果。

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Abstract：Twenty-three microsatellite markers were used to analyze the conservation efficiency of two local breeds (Beijing Fatty Chicken and Beijing Duck) in different farms.Genotypes were detected in 240 samples.The genetic variations among and within the populations were calculated by the number of alleles，genetic heterozygosity (H)，Polymorphism Information Content (PIC)，F-statistics，Nei’s genetic distance.High polymorphism were found in the two local breeds，and H values of each population were more than 0.5.All loci detected in this study showed polymorphism and the number of alleles ranged from 2 to 16，in addition to APL82 (Beijing Duck Ⅱ) homozygous loci.The different farms for the two breeds were shown to have retained substantial biodiversity，indicating that the conservation programs are efficient.However，differences between the farms of the same breeds were observed.

Keywords： conservation；Beijing Fatty Chicken；Beijing Duck；microsatellite