卵巢上皮性癌中p-AKT、PI3K和PTEN蛋白的表达及意义

程佳 杨晓龙 寻志杰 张彩英 司华鹏 彭志美 于华 霍艳

·论著·

卵巢上皮性癌中p-AKT、PI3K和PTEN蛋白的表达及意义

程佳 杨晓龙 寻志杰 张彩英 司华鹏 彭志美 于华 霍艳

目的探讨磷酸化AKT(p-AKT)、3-羧基磷脂酰肌醇激酶(PI3K)与张力蛋白同源的第10染色体丢失的磷酸酶基因(PTEN)在卵巢上皮性癌中的表达，分析它们之间的关系及其与卵巢上皮性癌患者预后的关系。方法应用免疫组织化学方法，检测10例正常卵巢组织，20例卵巢良性上皮性肿瘤，60例卵巢上皮性癌组织中p-AKT、PI3K和PTEN的表达。结果P-AKT和PI3K在正常卵巢组织、卵巢良性上皮性肿瘤中的阳性表达显著低于卵巢上皮性癌组织，而PTEN蛋白在卵巢上皮性癌组织中的表达显著低于正常卵巢组织、良性上皮性肿瘤(P均<0.01)。P-AKT、PI3K和PTEN表达与临床分期、病理分级、是否存在淋巴结转移及远处转移有关(P<0.01)，与年龄、病理类型及是否伴有腹水无关(P>0.05)。P-AKT和PI3K在卵巢上皮性癌中的表达呈正相关(r=0.552，P<0.01)，P-AKT和PTEN卵巢上皮性癌中的表达呈负相关(r=-0.497，P<0.01)，PI3K和PTEN卵巢上皮性癌中的表达呈负相关(r=-0.535，P<0.01)。结论P-AKT、PI3K的过表达伴随PTEN表达缺失参与卵巢上皮性癌的发生发展。

卵巢肿瘤；AKT；PTEN；PI3K；免疫组织化学

卵巢癌的发病率在女性生殖器官恶性肿瘤中位居第三位，但其致死率却占妇科肿瘤的首位，至今对于卵巢癌的发生机制仍不完全清楚。近年来信号传导通路与肿瘤的发生、发展、治疗及转归中的作用已经成为研究的热点。3羧基磷脂酰肌醇激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号传导通路参与细胞生长、增殖、分化调节，与多种肿瘤细胞的恶性行为有关[1]。PTEN(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10,PTEN)全称是与张力蛋白同源在10号染色体有缺失的磷酸酶基因。磷酸化和去磷酸化是调节细胞活动的重要方式，许多癌基因的产物都是通过磷酸化而刺激细胞生长。PTEN可能通过去磷酸化参与细胞调控。PTEN通过抑制PI3K/AKT通路，在肿瘤的发生、发展中起重要作用。本研究应用免疫组化方法探讨p-AKT、PI3K与PTEN在卵巢上皮性癌组织中的表达，分析它们之间的关系及其与卵巢上皮性癌患者预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2008年10月至2010年12月邯郸市第一医院住院患者存档的90份蜡块，包括正常卵巢组织10份(正常组)，卵巢良性上皮肿瘤组织20份(良性组)，卵巢上皮癌组织60份(卵巢癌组)。正常组患者年龄22～58岁，中位年龄40岁；良性组患者年龄20～50岁，中位年龄35岁；卵巢癌组年龄35～75岁，中位年龄55岁。3组年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。卵巢癌病理分级：G1 18例，G2 15例，G3 27例；按国际妇产科联盟(FIGO，1988年)标准进行手术病理分期：Ⅰ、Ⅱ期22例，Ⅲ、Ⅳ期38例。

1.2 主要试剂 兔抗人p-AKT多克隆抗体，兔抗人PI3K多克隆抗体，购自Cell Signaling Technology公司。兔抗人PTEN多克隆抗体，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。DAB显色剂、过氧化物酶标记的链霉卵白素标记盒(SP)试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 染色方法及结果判断标准 通过免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法对p-AKT、PI3K、PTEN蛋白的表达进行观察。染色设阴性及阳性对照。阴性对照使用磷酸盐缓冲液代替一抗，取p-AKT、PI3K、PTEN表达阳性的乳腺癌组织的石蜡切片作为阳性对照。结果判断标准：(1)据阳性细胞比例：光学显微镜下选取5个视野，每个视野随机选取100个细胞，计算阳性细胞数占总细胞数的比例作为阳性细胞比例，取平均值。①阳性细胞≤10%评1分；②阳性细胞为10%～50%评2分；③阳性细胞为51%～74%评3分；④阳性细胞≥75%评4分。(2)据阳性细胞染色强度：细胞不显色为0分；浅黄色为1分；棕黄色为2分；黄褐色为3分。阳性细胞比例乘以细胞染色强度积分为每例标本得分，范围为0～12分，其中0分为(-)，1～4分(﹢)，5～8分为(﹢﹢)，9～12分为(﹢﹢﹢)。阳性表达率的计算方法为阳性表达细胞数/总细胞数×100%。

1.4 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计数资料采用χ2检验，相关性应用Spearman等级相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 p-AKT、PI3K和PTEN在卵巢组织中的表达 卵巢上皮癌组织中p-AKT和PI3K的阳性表达率显著高于卵巢正常组织和良性组织(P<0.05)，卵巢正常组织与卵巢良性组织间的差异无统计学意义(P>0.05)。卵巢上皮癌组织中PTEN的阳性表达率显著低于卵巢正常组织和良性组织(P<0.05)，卵巢正常组织与卵巢良性组织间的差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 正常卵巢、卵巢良性肿瘤和上皮性卵巢癌中p-AKT、PI3K和PTEN的表达 例(%)

注：与卵巢癌组比较,*P<0.01

2.2 p-AKT、PI3K和PTEN蛋白与卵巢癌临床参数的关系 p-AKT、PI3K和PTEN的表达与卵巢上皮癌手术病理分期、病理分级有关 (P<0.05)，而与年龄、病理类型无关(P>0.05)。见表2。

表2 p-AKT、PI3K和PTEN蛋白与卵巢癌临床参数的关系

2.3 卵巢癌中p-AKT、PI3K和PTEN蛋白表达的关系 p-AKT和PI3K在上皮性卵巢癌中的表达呈正相关(r=0.552，P<0.01)，p-AKT和PTEN上皮性卵巢癌中的表达呈负相关(r=-0.497，P<0.01)，PI3K和PTEN上皮性卵巢癌中的表达呈负相关(r=-0.535，P<0.01)。见表3。

表3 卵巢癌中p-AKT、PI3K和PTEN蛋白表达的关系 例

3 讨论

PI3K的扩增、AKT的过度活化，或PI3K/AKT的某些调控成分如PTEN的功能缺失，可使PI3K/AKT通路的调节失调，进而导致多种肿瘤的发生、发展、侵袭、转移及化疗耐药。PI3K属于原癌基因，它是连接细胞外信号和细胞内应答的重要分子，在一系列信号分子的影响下，对细胞凋亡起重要作用。AKT属于丝氨酸/苏氨酸激酶，是一种信号转导蛋白。AKT表达水平增高后可以保护细胞免受凋亡，进而促进细胞生长[2]。AKT是PI3K下游的靶蛋白，PI3K活化的产物是AKT活化所必需的。PI3K活化的产物为磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)和磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)，它们可以使AKT的构象发生改变，导致AKT由细胞质转至细胞膜，通过一系列的级联反应使AKT发生活化，从而导致肿瘤的发生、发展[3]。有研究表明PI3K和AKT的过度表达在卵巢癌中普遍存在，导致细胞延迟死亡[4]，进而促进卵巢癌的发生。因此，p-AKT可能是卵巢癌发生、发展过程中的重要因素，并与卵巢癌的转归及预后密切相关。PTEN是肿瘤抑制基因，人体几乎所有组织都含这种蛋白质。它通过阻止细胞生长、分裂的速度过快或者分裂不受控制的方式，调控细胞分裂周期。PTEN蛋白可以通过去除磷酸基进而修饰其他蛋白质和脂肪。有报道PTEN突变后细胞内PIP3含量增高，使细胞重新表达PTEN后细胞内PIP3开始下降，说明PTEN是以PIP3为底物的磷酸酶，它使PIP3的3’位脱磷酸，从而形成PIP2，丧失PIP3的信使功能，成为拮抗PI3K、下调AKT通路的重要调节基因。因此，PTEN常被称为PI3K/AKT信号通路的“开关”。国外亦可见PTEN通过抑制PI3K/AKT通路抑制肿瘤发生发展的报道，包括卵巢癌[5]，黑色素瘤，胃癌，胶质瘤等[6，7]。

本研究发现，p-AKT及PI3K在卵巢组织中呈现高表达，而在正常卵巢组织中表达很弱。正常组及良性组的表达显著低于卵巢癌组(P<0.05)，提示p-AKT和PI3K可能对于卵巢癌的发生、发展及预后起重要作用。随着卵巢癌的临床期别上升，肿瘤细胞的分化程度下降，p-AKT和PI3K的阳性表达率越高。有研究发现从正常卵巢上皮细胞到不典型增生再到卵巢癌的转化过程中，p-AKT和PI3K的表达水平不断增高，并可伴随肿瘤抑制基因的失调节，从而丧失肿瘤抑制基因抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用，是p-AKT和PI3K提高卵巢肿瘤细胞生存能力的证据[8]。

本实验表明正常卵巢组织中PTEN的阳性表达率明显高于卵巢上皮性癌组织，随着PTEN的阳性表达率显著下降，其抑制肿瘤细胞生长及促进肿瘤细胞凋亡和能力逐渐减弱，无法使PTEN编码的产物PIP3在D3位去磷酸化生成PIP2，从而丧失了对P13K/Akt信号通路的负性调节。因此，PTEN的表达缺失促进了卵巢癌的发生。正常组、良性组中PTEN的阳性表达与卵巢癌组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。而良性组与正常组比较差异无统计学意义(P<0.05)，反映了PTEN对肿瘤细胞增殖的抑制程度。

PTEN的表达水平与AKT的磷酸化水平呈负相关，且患者的生存期与PTEN的表达水平呈正相关、与AKT的磷酸化水平呈负相关。PTEN的表达水平随着卵巢癌病理分级及临床分期的升高而下降，卵巢癌细胞分化程度与PTEN的阳性表达率呈正相关。有实验证实PTEN可以抑制卵巢癌细胞的生长、促进卵巢癌细胞的凋亡、提高卵巢癌细胞对抗癌基因的敏感性[9]，并与化疗耐药有关[10]。因此，PTEN蛋白可能是评价卵巢癌恶性生物学行为的重要参考指标，并可能会成为卵巢癌早期诊断和评价预后的重要分子标志物。因此以PI3K/AKT通路为靶点的小分子药物将有望对卵巢癌的治疗起到非常重要的作用，并为解决化疗耐药问题提供新思路。

1 郭瑞霞，魏丽惠.磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号传导通路与妇科恶性肿瘤的研究进展.中华妇产科杂志，2005，40：358-360.

2 Brodbeck D,Cron P,Hemmings B,et al.A human protein kinase Bgamm with regulatory phosphorylation sites in the activation loop and in the C-terminal lydrophobic domain.J Biol Chem,1999,274:9133-9136.

3 Saga Y,Mizukami H,Suzuki M,et al.Overexpression of PTEN increases sensitivity to SN-38,an active metabolite of the topoisomerase I inhibitor irinotecan,in ovarian cancer cells.Clin cancer Res,2002,8:1248-1252.

4 Nicholson KM,Anderson NG.The protein kinase B/Akt singnalling pathway in human malignancy.Cell Signal,2002,14:381-395.

5 Sansal I,Sellers W.The Biology and Clinical Relevance of the PTEN Tumor Suppressor pathway.J Clin Oncol,2004,22:2954-2963.

6 Maehama T,Dixon JE.The tumor suppressor,PTEN/MMAC1,dephosphorylates the lipid second messenger,phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate.J Biol Chem,1998,273: 13375-13378.

7 Waite KA,Eng C.Protean PTEN: form and function.Am J Hum Genet,2002,70:829-844.

8 Wang HQ,Altomare DA,Skele KL,et al.Positive feedback regulation between AKT activation and fatty acid synthase expression in ovarian carcinoma cells.Oncogene,2005,24:3574-3582.

9 Wu R,Hendrix-Lucas N,Kuick R,et al.Mouse Model of Human Ovarian Endometrioid Adenocarcinoma Based on Somatic Defects in the Wnt/beta-Catenin and PI3K/Pten Signaling Pathways.Cancer Cell，2007,11:321-333.

10 Pandey SK,He HJ,Chesley A,et al.Wortmannin-sensitive pathway is required for insulin-stimulated phosphorylation of inhibitor kappa Balpha.Endocrinology,2002,143:375-385.

ExpressionandsignificanceofphosphorylatedproteinkinaseB,PI3KandPTENproteininovarianepithelialcancer

CHENGJia*,YANGXiaolong,XUNZhijie*,etal.*TheFirstHospitalofHandanCity,Hebei,Handan056002,China

ObjectiveTo analyze the expression and significance of phosphorylated protein kinase B (p-AKT),PI3K and PTEN protein in ovarian epithelial cancers and to investigate the correlation among them and the correlation between their expression and prognosis of patients with ovarian epithelial cancer.MethodsThe positive expression rates of p-AKT,PI3K and PTEN were detected by immunohistochemical method in 10 cases of normal ovarian tissues,20 cases of ovary benign epithelial tumors and 60 cases of ovarian epithelial cancers.ResultsThe positive expression rates of p-AKT and PI3K in normal ovarian tissues and ovary benign epithelial tumors were significantly lower than those in ovarian epithelial cancers,however,the positive expression rates of PTEN in ovarian epithelial tissues were significantly lower than those in normal ovarian tissues and ovary benign epithelial tumors (P<0.01).The expression levels of p-AKT,PI3K and PTEN were closely correlated to clinical stage,differentiation degree of cancer cells,pathological classification and lymph node metastasis (P<0.01),however,which were not related to patient's age,histological type and ascites (P>0.05).The expression of p-AKT was positively related to that of PI3K in ovarian epithelial cancer (r=0.552,P<0.01),however,the expression of p-AKT was negatively related to that of PTEN in ovarian epithelial cancer (r=-0.497,P<0.01),and the expression of PI3K was negatively correlated to that of PTEN in ovarian epithelial cancer (r=-0.535,P<0.01).ConclusionThe overexpression of p-AKT and PI3K followed by absence of PTEN are involved in the pathogenesis and development of ovarian epithelial cancer.

ovarian cancer; AKT; PTEN; PI3K;immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.04.006

056002 河北省邯郸市第一医院(程佳、寻志杰、张彩英、司华鹏、彭志美、于华、霍艳)；河北省邯郸市中心医院(杨晓龙)

R 737.31

A

1002-7386(2014)04-0501-04

2013-08-11)